SUMS0382申克孢子絲菌生物學特性及免疫正常動物模型建立的初步研究.pdf

1、孢子絲菌病是一種皮膚、皮下組織及其附近淋巴系統的亞急性或慢性真菌感染，有時可波及各臟器。其致病菌申克孢子絲菌(Sporothrix schenckii，簡稱Sschenckii)廣泛存在于自然界，尤其是熱帶和亞熱帶地區(qū)，中國亦為高發(fā)地區(qū)。 S．schenckii的形態(tài)特征是與其它雙相型真菌鑒別的重要依據，同時與其致病性關系密切。其在25℃生長狀態(tài)為菌絲相，表現為淡褐色至深褐色或黑色菌落，有皺褶或溝紋，可見灰白色短絨毛狀菌絲，鏡

2、下可見纖細分支分隔菌絲，生孢子梗位于菌絲兩側直角長出，呈梅花朵樣或“套袖”狀排列；37℃為酵母相，表現為白色至灰黃色酵母樣菌落，鏡下可見圓形、長形或者梭形孢子，有出芽。雙相型轉化是S．schenckii的重要特征之一，轉化條件較復雜，存在菌株特異性，并且與菌株的毒力相關。S．schenckii侵入宿主后，通過一系列的形態(tài)學改變來適應宿主的內環(huán)境，造成組織損傷，抵抗宿主免疫殺傷。目前大多數學者認為酵母相是S．schenckii的致病形態(tài)。

3、 孢子絲菌病呈慢性病程，發(fā)病部位皮膚組織纖維化導致其治療周期長，費用高，而且已有對兩性霉素B治療失敗的報道，亦有對伊曲康唑MIC值較高的報道，因此有必要進行體外藥敏試驗及耐藥菌株的臨床監(jiān)測。《美國傳染病協會2007版孢子絲菌病臨床治療指南》推薦，伊曲康唑作為非系統性孢子絲菌病的首選單獨治療藥物，很多學者亦嘗試了聯合治療，并取得一定療效。而與之相關的體外藥敏試驗仍處于探索階段，由于影響因素較多，哪一種生長形態(tài)的藥敏試驗結果更為準確

4、可靠、并用以指導該病治療尚存爭議。目前尚無S．schenckii對伊曲康唑耐藥的報道，亦無相關藥敏試驗耐藥標準的報道，對其耐藥機制需進一步探討。 盡管很多學者通過建立動物模型的方式，對S．schenckii的致病性、宿主免疫反應及治療方面進行了探討，但迄今為止仍未有明確的闡述。動物模型的建立是由宿主和受試菌株共同決定的，影響因素較多，既往文獻報道動物模型多是在免疫抑制基礎上建立的，既不能反應疾病的自然進程，也不能反應宿主的正常免

5、疫作用。因此建立理想的孢子絲菌菌病動物模型，模擬自然發(fā)病過程，對該疾病發(fā)病機制的闡明及治療藥物的療效評價具有重要意義。本課題擬通過對分離自1例伊曲康唑治療失敗的孢子絲菌病患者的臨床菌株SUMS0382的生物學特性及所建立的相應慢性皮膚感染動物模型進行研究，有助于闡述S．schenckii的致病性。 第一部分：SUMS0382申克孢子絲菌的生物學特性研究 目的：探討SUMS0382申克孢子絲菌的酵母相轉化條件、生長抑制溫度

6、及體外藥敏試驗，進一步明確其真菌生物學特性。 方法：1.酵母相轉化。將實驗菌株傳代活化2次后，超凈工作臺內，挑取生長良好的菌落團塊，采用劃線接種法，接種于BHIA+5％羊血斜面試管和BHIA+0.5％GS余面試管，各2管，置CO2恒溫溫箱35℃培養(yǎng)。必要時連續(xù)傳代，直至轉化成功，獲得灰白色酵母型菌落。2.溫度生長抑制試驗。將酵母相實驗菌株，采用劃線接種法，接種于SDA平板、PDA平板、BHIA平板、BHIA+5％羊血平板和BHI

7、A+0.5％GS平板，各2個，分別置35℃、36℃、37℃和38℃CO2恒溫溫箱培養(yǎng)14d，觀察各菌株生長情況，記錄各實驗菌株的停止生長溫度。3.伊曲康唑和特比萘芬體外聯合藥敏試驗?；罨?，分別制備菌絲相和酵母相菌懸液，菌絲相濃度調整至5×104 CFU/ml(2倍終濃度)，酵母相調整至2.5×103 CFU/ml(2倍終濃度)；采用微量液基稀釋法加樣制板后，菌絲相置25℃，酵母相置35℃孵育，第5d觀察結果。結果判斷標準為各藥的MI

8、C終點為100％生長抑制，聯合用藥效果評價采用分數抑菌濃度指數評價。4株菌均進行3次重復試驗。 結果：1.通過連續(xù)傳代，成功獲取4株申克孢子絲菌的酵母相。2.SUMS0382、BMU02035和SUMS0383在35℃和37℃生長較好，36℃生長差，38℃時停止生長，BMU00471均生長良好。3.體外聯合藥敏試驗顯示伊曲康唑和特比萘芬不論單獨應用還是聯合應用，菌絲相GM值均高于酵母相；兩藥相互作用結果顯示：菌絲相時，SUMS0

9、383和BMU00471顯示相加作用，SUMS0382和BMU02035顯示無關作用；酵母相時，SUMS0382、SUMS0383和BMU02035顯示相加作用，BMU00471表現為無關作用。 結論：1.該菌株酵母相轉化需要富含營養(yǎng)的培養(yǎng)基，連續(xù)傳代，35℃是適宜溫度。2.菌株SUMS0382的生長抑制溫度為38℃。3.生長時相對S．schenckii MIC值有明顯影響，體外聯合藥敏試驗是可行的。 第二部分：SUMS

10、0382申克孢子絲菌慢性皮膚感染Wistar大鼠模型的建立 目的：觀察免疫正常Wistar大鼠皮膚型孢子絲菌病的發(fā)病過程，探討其慢性皮膚感染動物模型建立的可行性及實驗條件。 方法：1.實驗動物。42只Wistar大鼠，雌雄各半，體重90-100g。2.實驗性感染。采用化學脫毛法于大鼠背部脫毛，脫毛區(qū)約3cm×3cm。水合氯醛腹腔麻醉后，采用皮下注射法，在脫毛區(qū)注射孢子絲菌SUMUS0382菌懸液0.1ml，約含1×107

11、個孢子，分3點接種，拔針時，輕按針孔片刻，防止菌液逸出。3.發(fā)病情況觀察。自接種之日起，每日觀察大鼠的生長發(fā)育情況(體重、存活率)及發(fā)病情況(皮損形成時間，結節(jié)、糜爛、潰瘍、結痂等)，觀察時間為12w。4.組織培養(yǎng)與組織病理。接種后4w、8w、12w各取2只發(fā)病大鼠，切取結節(jié)后，分為兩部分，一部分用10％福爾馬林固定，石蠟切片，分別行HE和PAS染色，鏡下觀察組織病理變化；另一部分無菌操作下剪碎組織，接種沙氏培養(yǎng)基(SDA)和腦心浸汁羊

12、血培養(yǎng)基(BHIA)，分別置25℃和35℃培養(yǎng)。 結果：1.接種2w后可見結節(jié)長出，4w時有結節(jié)老鼠數量最多，隨后部分結節(jié)可消退，未消退者結節(jié)緩慢增大，主要局限于接種點。其中一只大鼠70d時皮損出現化膿，潰瘍。觀察期內，所有大鼠生長發(fā)育好，未出現死亡。2.第4w、8w、12w皮損組織SDA25℃培養(yǎng)，可見典型菌落，且色素較原菌株加深；BHIA35℃培養(yǎng)，可見酵母型菌落。3.三個觀察時段組織病理均可見感染性肉芽腫，呈現典型的“三帶