過表達(dá)ICAM-1對間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性影響及自身免疫性甲狀腺炎動物模型的建立.pdf

1、目的:
　　 1.構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MIGR1-ICAM-1，探討細(xì)胞間粘附分子1(Intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)基因轉(zhuǎn)染對小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)生物學(xué)特性的影響。為進(jìn)一步研究ICAM-1是否影響MSCs對自身免疫性甲狀腺炎(Autoimmune Thyroiditis，AIT)體內(nèi)治療效果提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2、　　 2.利用外源性甲狀腺球蛋白免疫C57BL/6小鼠建立AIT的動物模型——實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎(Experimental Autoimmune Thyroiditis，EAT)，為下一步開展大規(guī)模體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定可靠的動物模型。
　　 方法:
　　 1.通過RT-PCR方法擴(kuò)增獲得小鼠脾細(xì)胞ICAM-1基因全長DNA，將其克隆至中間載體pMD19-T，行雙酶切及DNA測序鑒定后，將ICAM-1基因連接至逆轉(zhuǎn)錄病

3、毒載體MIGR1上，對重組載體MIGR1-ICAM-1進(jìn)行雙酶切、RT-PCR及DNA測序分析。
　　 2.將獲得的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒MIGR1-ICAM-1及空質(zhì)粒MIGR1均加入包裝質(zhì)粒ECOS后分別轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞(T293細(xì)胞)，將獲得攜帶ICAM-1基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒MIGR1-ICAM-1及空載體逆轉(zhuǎn)錄病毒MIGR1，分別感染C3H10T1/2細(xì)胞，熒光倒置顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達(dá)，real-time PCR和流式細(xì)胞

4、術(shù)檢測ICAM-1在基因水平和蛋白水平的表達(dá)。同時檢測三種細(xì)胞的形態(tài)、表型、生長特點(diǎn)及成脂成骨分化等一般生物學(xué)特性;并通過淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(Lymphocyte transformation test，LTT)及混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)(Mixed lymphocyte reaction，MLR)檢測三種細(xì)胞的免疫學(xué)特性。
　　 3.建立EAT動物模型，將5周齡雌性C57BL/6小鼠于第0d和第14d用豬甲狀腺免疫球蛋白(Porc

5、ine Thyroglobuli，PTg)及弗氏佐劑(Freund's adjuvant，F(xiàn)A)進(jìn)行兩次免疫;于實(shí)驗(yàn)第28d眼球取血，測血清甲狀腺球蛋白抗體(Thyroglobulin Antibody，TgAb)、甲狀腺過氧化物酶抗體(AntithyroidPeroxidase Antibodies，TPOAb)、甲狀腺微粒體抗體(Thyroid microsomalAutoantibody，TMAb)水平，并分離甲狀腺組織行HE染色

6、及組織病分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.對重組載體MIGR1-ICAM-1雙酶切和RT-PCR電泳均顯示獲得1700bpICAM-1目的基因片段;DNA測序結(jié)果顯示與基因文庫中的小鼠ICAM-1基因序列完全相同，且插入方向正確，從而證實(shí)成功構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MIGR1-ICAM-1。
　　 2.逆轉(zhuǎn)錄病毒感染C3H10T1/2細(xì)胞后，熒光倒置顯微鏡下可見絕大部分細(xì)胞表達(dá)綠色熒光;real-time PCR和流

7、式細(xì)胞術(shù)分別在轉(zhuǎn)錄水平(相對表達(dá)量1625.82±119.42)和蛋白水平（表達(dá)量90.3％）證實(shí)ICAM-1在C3H10T1/2細(xì)胞中均有高表達(dá)，從而證明獲得穩(wěn)定過表達(dá)ICAM-1的間充質(zhì)干細(xì)胞系C3H10T1/2(C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC)。
　　 3.進(jìn)一步對過表達(dá)ICAM-1的C3H10T1/2細(xì)胞的生長特性、誘導(dǎo)分化能力及免疫學(xué)功能進(jìn)行研究，結(jié)果表明，過表達(dá)ICAM-1可使C3H10T1/2

8、細(xì)胞(29.18±2.47)％處于S期，且倍增時間縮短。在成脂誘導(dǎo)分化中，C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC獲得脂肪細(xì)胞數(shù)顯著降低(12.18±3.83/孔)，且脂滴變小;real-time PCR檢測成脂分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα和PPARγ的表達(dá)均顯著下調(diào);同樣，在成骨分化中，過表達(dá)ICAM-1可使C3H10T1/2成骨分化的堿性磷酸酶活性及礦化骨結(jié)節(jié)形成能力顯著下降，關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osteocalci

9、n在mRNA表達(dá)水平亦顯著降低，提示過表達(dá)ICAM-1可顯著降低MSCs的成脂和成骨分化能力。
　　 4.利用淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(Lymphocyte transformation test，LTT)和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Mixed lymphocyte reaction，MLR)對過表達(dá)ICAM-1的MSCs進(jìn)行免疫功能檢測，結(jié)果顯示，在LTT體系中，當(dāng)MSCs∶T細(xì)胞分別為1∶40和1∶5時， C3H10T1/2-MIGR1-

10、ICAM-1/MSC與對照組 C3H10T1/2-MIGR1/MSC的cpm值分別為(1955.25±292.60)、(2285.33±303.67);(812.00±21.17)、(1335.00±209.18);同樣，在MSCs作為滋養(yǎng)層的MLR反應(yīng)體系中，當(dāng)刺激細(xì)胞∶效應(yīng)細(xì)胞為1∶1和1∶25時，C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC與對照組C3H10T1/2-MIGR1/MSC的cpm值分別為(1598.50±11

11、0.74)、(1859.00±111.25);(1147.50±55.91)、(1493.00±98.33)。提示過表達(dá)ICAM-1的MSCs具有顯著抑制T細(xì)胞增殖的能力，且具有劑量依賴性，隨著MSCs數(shù)量的增加，其抑制能力逐漸增強(qiáng)。
　　 5.C57BL/6小鼠經(jīng)外源性甲狀腺球蛋白皮下免疫誘導(dǎo)后，結(jié)果顯示，模型組小鼠血清中TPOAb、TMAb、TgAb的水平[(60.36±4.53)、(67.47±6.25)、(65.67±5

12、.35)]均顯著高于對照組小鼠[(21.45±4.66)、(7.68±2.76)、(7.59±2.23)];甲狀腺病理顯示濾泡間質(zhì)存在淋巴細(xì)胞浸潤情況，具有典型EAT特征。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究通過構(gòu)建ICAM-1的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MIGR1-ICAM-1，成功獲得穩(wěn)定過表達(dá)ICAM-1的間充質(zhì)干細(xì)胞系C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC。
　　 2.對過表達(dá)ICAM-1的MSCs生物