豬丹毒絲菌疫苗用菌株篩選及其CbpB蛋白表達(dá)與鑒定.pdf

1、豬丹毒是由豬丹毒絲菌引起的一種人畜共患傳染病。預(yù)防接種是防制豬丹毒最有效的辦法。豬丹毒絲菌有26種血清型（1a、1b、2-24和N型），中國(guó)主要為1a型(80％～90％)和2型。豬丹毒菌苗包括滅活苗（2型為主）和弱毒菌（1型或2型），1型和2型菌苗對(duì)其他血清型菌株的感染具有交叉保護(hù)。膽堿結(jié)合蛋白B(CbpB)作為豬丹毒絲菌表面保護(hù)性抗原，在發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。本研究從42株豬丹毒絲菌安徽分離株（血清型均為1a型）中，通過(guò)致病性、抗原

2、性和穩(wěn)定性試驗(yàn)，篩選豬丹毒絲菌疫苗用菌株;原核表達(dá)猜丹毒絲菌CbpB蛋白鑒定其免疫活性，旨為研制免疫保護(hù)性更佳的疫苗及其聯(lián)合疫苗、豬丹毒絲菌亞單位疫苗提供技術(shù)儲(chǔ)備。
　　根據(jù)小鼠致死性試驗(yàn)結(jié)果，初步篩選出4株豬丹毒絲菌（AEr9、AEr21、AEr31和AEr32）為受試菌株。第一，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法、改良寇氏法測(cè)定菌株生長(zhǎng)曲線及半數(shù)致死量(LD50)。第二，利用甲醛滅活全菌體，免疫兔制備陽(yáng)性血清，采用微量平板凝集和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)血

3、清的凝集效價(jià)和抗體滴度;滅活全菌體免疫小鼠，進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，測(cè)定免疫保護(hù)率。第三，受試菌株傳代培養(yǎng)30代，取第10、20、30代菌株分別檢測(cè)LD50、沉淀抗體滴度、免疫保護(hù)率。第四，綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，篩選出豬丹毒絲菌疫苗用菌株。第五，PCR擴(kuò)增AEr21的cbpB基因，克隆至pMD18-T載體，構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-cbpB，陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和谷胱甘肽親和層析柱純化目的蛋白，再經(jīng)SDS-

4、PAGE和Western blot鑒定蛋白的免疫活性。
　　結(jié)果顯示:AEr9、AEr21、AEr31和AEr32的LD50分別為10.09CFU/mL、35.5CFU/mL、50.3CFU/mL、845CFU/mL，擇優(yōu)選出AEr21、AEr31和AEr32。成功制備滅活全菌體V-AEr21、V-AEr31和V-AEr32，獲得兔抗豬丹毒絲菌陽(yáng)性血清Ab-AEr21、Ab-AEr31和Ab-AEr32，其中Ab-AEr21、Ab

5、-AEr31與Ag-AEr21、Ag-AEr31、Ag-AEr32的凝集效價(jià)均為50％～75％，沉淀抗體滴度均達(dá)1∶24，抗原性?xún)?yōu)于Ab-AEr32;滅活全菌體V-AEr21對(duì)AEr21、AEr31的攻毒保護(hù)率為100％～80％，V-AEr31對(duì)AEr21、AEr31的攻毒保護(hù)率為100％～60％，免疫保護(hù)力均優(yōu)于V-AEr32。AEr21、AEr31在傳代10代內(nèi)LD50分別上至103.39CFU/mL和103.64CFU/mL，之后

6、趨于穩(wěn)定至第30代;滅活全菌體V-AEr21和V-AEr31沉淀抗體效價(jià)分別由第10代1∶24和1∶23均下降至第30代1∶22;第10代-第30代V-AEr21和V-AEr31對(duì)AEr21的攻毒保護(hù)率分別為100％～80％和60％，而對(duì)AEr31的攻毒保護(hù)率分別為80％～40％和100％～80％。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-cbpB在大腸桿菌BL21中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，獲得大小為73kD的目的蛋白，與預(yù)期大小的CbpB蛋白分子質(zhì)量一致，