豬丹毒桿菌噬菌體分離、鑒定及應(yīng)用研究.pdf

1、豬丹毒(Swine Erysipelas)也叫鉆石皮膚病(diamond skin disease)或紅熱病(red fever)，是由紅斑丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）引起的一種急性、熱性傳染病。近年來豬丹毒發(fā)病趨勢愈演愈烈，各地不時(shí)有豬丹毒發(fā)生的報(bào)道，給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，控制豬丹毒桿菌的方法主要有兩種:一是通過接種疫苗，二是藥物治療。而在此前的報(bào)道中表明豬丹毒桿菌對大

2、對數(shù)抗生素具有耐藥性，一旦抗生素對該菌失去殺滅作用，勢必會(huì)造成豬丹毒的再次大規(guī)模爆發(fā)。噬菌體(Bacteriophage)是一種細(xì)菌病毒，可吸附到宿主細(xì)菌表面，在其體內(nèi)生長繁殖，并最終使細(xì)菌裂解，以此可起到特異性殺滅宿主細(xì)菌的作用。我們通過對豬丹毒桿菌噬菌體進(jìn)行分離、純化及其宿主譜的研究，表明該噬菌體可特異性殺滅豬丹毒桿菌，并對其在小鼠體內(nèi)的殺菌情況做了一系列研究。通過對其基因組分析得到該噬菌體裂解細(xì)菌的關(guān)鍵性蛋白-裂解酶，并對其裂菌條

3、件做了一系列的優(yōu)化，具體研究內(nèi)容分為以下3個(gè)部分:
　　1.豬丹毒桿菌噬菌體分離、鑒定
　　2014年8月，江蘇省鹽城市一家豬場-上海農(nóng)場爆發(fā)豬丹毒，經(jīng)過剖檢病死豬發(fā)現(xiàn)其心、肝、腎、脾均呈典型的敗血癥變化。從發(fā)病豬豬舍周圍的環(huán)境中采取泥土、糞便并分離獲得豬丹毒桿菌噬菌體，我們將其命名為SE-1。經(jīng)過連續(xù)5次單斑純化后，擴(kuò)增培養(yǎng)該噬菌體并通過電鏡觀察該噬菌體形態(tài)。SE-1頭部為正二十面體的長尾噬菌體。提取該噬菌體基因組進(jìn)行高通

4、量測序，SE-1基因組大小為34997bp，GC含量為34％，包含43個(gè)開放閱讀框（表達(dá)噬菌體的包裝蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、裂解酶-穿孔素蛋白以及假設(shè)蛋白）。通過蔗糖密度梯庋離心純化噬菌體顆粒，并通過液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析SE-1的結(jié)構(gòu)蛋白成分，鑒定出ORF9、ORF15、ORF23、ORF30、ORF31、ORF33、ORF39、ORF40和ORF42等九個(gè)蛋白。應(yīng)用終止酶大亞基序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹來分析SE-1同源性，表明該噬菌體與葡萄球菌噬

5、菌體P954和phi3396同源性較高。通過蝕斑實(shí)驗(yàn)表明SE-1可感染13株實(shí)驗(yàn)室保存的豬丹毒桿菌中的7株，但是不能感染沙門氏菌、鏈球菌和葡萄球菌。這是首例關(guān)于豬丹毒桿菌噬菌體特性、基因組和蛋白組的報(bào)道，該研究的成功開展將有助于開發(fā)一種抗豬丹毒桿菌的新藥物。
　　2.噬菌體動(dòng)物體內(nèi)的治療實(shí)驗(yàn)
　　由于噬菌體具有高度的宿主特異性，有別于抗生素會(huì)影響正常菌群。因此，近年來，噬菌體用于治療人和動(dòng)物細(xì)菌性疾病方面的潛在價(jià)值受到廣泛的

6、關(guān)注。在之前的研究工作中，我們實(shí)驗(yàn)室成功分離出豬丹毒桿菌噬菌體，并將其命名為SE-1。本實(shí)驗(yàn)為了研究豬丹毒桿菌噬菌體在體內(nèi)是否具有殺菌功能，我們統(tǒng)計(jì)出豬丹毒桿菌的半數(shù)致死量并且對注射部位、注射時(shí)間、注射劑量等對噬菌體SE-1用于治療的條件進(jìn)行優(yōu)化，通過菌落計(jì)數(shù)觀察小鼠血液中豬丹毒桿菌的變化檢測噬菌體SE-1在小鼠體內(nèi)的殺菌作用。實(shí)驗(yàn)證明，在優(yōu)化條件后，同未注射噬菌體的陰性對照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠在注射噬菌體72h后，小鼠體內(nèi)細(xì)菌數(shù)量減少1

7、0倍左右，證明了豬丹毒桿菌噬菌體在小鼠體內(nèi)具有殺菌的功能。為后續(xù)開發(fā)治療豬丹毒桿菌感染的新藥物開辟一條新道路。
　　3.豬丹毒桿菌噬菌體裂解酶的表達(dá)及應(yīng)用研究
　　噬菌體裂解酶是在噬菌體DNA感染細(xì)菌后期表達(dá)的一種蛋白，可高效水解細(xì)菌細(xì)胞壁以釋放子代噬菌體，在體外可特異性的殺死細(xì)菌。本實(shí)驗(yàn)的目的旨在克隆和表達(dá)豬丹毒桿菌噬菌體裂解酶Ely并檢測其是否具有生物學(xué)活性。通過對豬丹毒桿菌噬菌體基因紐進(jìn)行測序及生物學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)SE-1

8、表達(dá)裂解酶，對該噬菌體裂解酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a(+)-Ely，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌B121(Rosetta)中，以1mmol/l IPTG在28℃誘導(dǎo)8h，通過SDS-PAGE鑒定蛋白高效表達(dá)在上清中，通過Ni2+-NTA親和層析法純化目的蛋白，其純度在90％以上，以100μg/ml,10μg/ml，1μg/ml的終濃度作用于豬丹毒桿菌，并每隔1h收集樣品進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，直到7h，設(shè)未加入裂解酶的陰性對照。并且從作