6個小麥葉銹菌菌株差異表達譜分析及其候選效應蛋白的篩選.pdf

1、小麥葉銹菌(Puccinia triticina，Pt)是一類高度?；幕铙w營養(yǎng)型真菌，其引起的小麥葉銹病嚴重影響世界小麥安全生產(chǎn)。專性寄生真菌的特殊寄生結構—吸器產(chǎn)生的效應蛋白在病原菌致病性和寄主抗病性研究中扮演著重要角色。小麥葉銹菌的致病機制研究對于有效防控小麥葉銹病具有重要意義，而開展效應蛋白的研究對于揭示致病機制意義突出。因此，本試驗在對6個不同毒力的小麥葉銹菌菌株09-12-284-1、09-19-727-1、08-5-11-

2、1、04-15-7、03-5-99和08-5-260-2轉錄組測序的基礎上，通過表達差異基因分析、利用生物信息學軟件預測篩選候選效應蛋白，利用Pfam尋找功能結構，查找已報道病原真菌效應蛋白motif,利用MEME軟件分析候選效應蛋白的未知保守結構域。隨機克隆了部分致病相關基因的ORF序列，最后用半定量RT-PCR和qRT-PCR分析所克隆部分基因的表達模式，初步推斷其生物學功能，研究將推進對小麥葉銹菌致病機制及其與寄主植物的互作機制的

3、研究進程。
　　本試驗主要研究結果如下:
　　1、對6個不同毒力小麥葉銹菌菌株轉錄組數(shù)據(jù)進行兩兩對比，共獲得差異表達基因319004個次，顯著差異表達基因26531個次。每個比對組合的差異表達基因在21266左右，而顯著差異表達基因的數(shù)量平均為1768個，但不同組合間存在顯著差異。Tc727-VS-Tc11的顯著差異表達基因最多，為4334個，而Tc99-VS-Tc260的顯著差異表達基因最少，僅有47個。顯著差異表達基因的

4、功能主要涉及生物調(diào)節(jié)、細胞過程、生物負調(diào)控、生物正調(diào)控、生殖、復制、響應機制、信號轉導、大分子復合物、細胞膜組分、各類細胞器、抗氧化作用、結合作用、催化作用、電子載體、酶、金屬伴侶、分子轉導、蛋白結合的轉錄因子、核酸結合的轉錄因子及轉運等功能。但從各自比較組合中發(fā)現(xiàn)，在不同的功能類型中，涉及到的具體功能條目的數(shù)量和基因存在差異。
　　2、利用SignalP4.1，TargetP1.1，TMHMM2.0和EffectorP生物信息學

5、軟件組合層層篩選，步步縮小范圍預測effector。最后得到702個候選分泌蛋白，311個候選小麥葉銹菌效應蛋白。
　　3、Pfam和在線軟件CD Search對候選效應蛋白進行功能結構域預測，得到95個含有保守結構的效應蛋白，主要包括一些熱激蛋白、類甜蛋白家族、糖苷水解酶家族、細胞色素P450、轉運蛋白以及CFEM真菌致病相關結構等。對未知結構的候選效應蛋白用Meme軟件分析，發(fā)現(xiàn)了3個新的保守結構域。
　　4、Perl軟

6、件搜索候選效應蛋白，共找到121個基因含有已知效應蛋白保守結構，其中11個含有RxLR結構域（卵菌），3個含有G[I/F/Y][A/L/S/T]R結構域（亞麻銹菌），87個含有[Y/F/W]xC結構域（白粉病菌），35個含有[L/I]xAR結構域（稻瘟病菌），同時還預測到了3個新的保守基序，說明小麥葉銹菌中含有豐富的效應蛋白保守基序。
　　5、成功克隆候選效應蛋白基因14個，分別是Unigene4156(481 bp)、Unige

7、ne4204(391bp)、Unigene5212(451bp)、Unigene8006(550bp)、Unigene8382(383bp)、Unigene12160(508bp)、Unigene20419(775bp)、Unigene8119(759bp)、Unigene4298(778bp)、Unigene22481(235bp)、Unigene16325(370bp)、Unigene5071(659bp)、Unigene2873(

8、211bp)和Unigene23963(210bp)。這些基因均與小麥稈銹菌假定功能蛋白相似，主要參與細胞組成、分子功能及生物過程。
　　6、經(jīng)qRT-PCR定量結果分析得出:Unigene4204、Unigene20419、Unigene5071、Unigene23963和Unigene12160在小麥葉銹菌侵染的早期誘導表達，推測這些基因可能是參與早期誘導、抑制寄主防御反應的信號傳導;Unigene8006、Unigene81

9、19、Unigene8382、Unigene22481和Unigene4298在侵染的后期誘導表達，在吸器大量形成時候高表達，推測這些基因可能與吸器寄生、銹菌產(chǎn)孢有關，極有可能是由吸器分泌出的致病相關因子。
　　從轉錄組水平分析不同菌株的差異表達情況，可以揭示出不同菌株之間大量的差異表達基因，轉錄組分析是揭示差異表達基因的良好途徑。利用多種工具和分析方法可以從大量的表達基因中獲得候選的效應蛋白，多種方法結合，層層篩選，特別是增加E