在小麥—葉銹菌互作過程中TaEDS1基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、小麥葉銹菌屬于專化性非常強(qiáng)的活體寄生真菌。本試驗室前期工作已經(jīng)證明，在不親和組合中，侵染點(diǎn)及其周圍少數(shù)細(xì)胞迅速死亡，發(fā)生過敏性反應(yīng)(hypersensitivereaction，HR)，從而限制菌的發(fā)育。并且前期工作通過構(gòu)建葉銹菌侵染早期的小麥SSH文庫及ESTs序列分析，篩選到EDS1生不親合組合接種后表達(dá)量有所增加。EDS1蛋白是植物免疫系統(tǒng)中防御第一線中非常重要的一個組分。最新的研究結(jié)果揭示擬南EDS1可直接作為病原效應(yīng)物的靶蛋白

2、，通過與TIR-NBB-LRR類抗性蛋白互作調(diào)控免疫反應(yīng)。由于目前在單子葉植物中還沒有檢測到TIR-NBB-LRR類抗性蛋白的存在，在單子葉植物中EDS1是否參與寄主抗病反應(yīng)？這一問題成為我們關(guān)注的焦點(diǎn)。本試驗以小麥品種洛夫林10分別與葉銹菌小種260、165組成不親和組合及親和組合，初步探討TaEDS1在小麥抵抗葉銹菌侵染中的作用，取得如下結(jié)果:
　　1、在已知的TaEDS11351 bp片段的基礎(chǔ)上，利用5'RACE技術(shù)，向5

3、'端延長了200bp左右。利用延長得到的約1551 bp的序列進(jìn)行比對，比對出一段小麥基因組DNA序列，將此序列與二穗短柄草的EDS1的CDS比對，去除內(nèi)含子序列，最終得到TaEDS1完整CDS，全長1872 bp。
　　2、選取了在小麥基因表達(dá)分析中常用的8個管家基因ACTIN、ACTIN2、GAPDH、GAPDH2、ATUB、BTUB、EF1A、EF1A2以及在小麥感染條銹菌中篩選到的穩(wěn)定表達(dá)的TA共9個基因作為候選內(nèi)參基因，

4、利用qRT-PCR技術(shù)及GeNorm和NormFinder軟件分析，篩選到在小麥與葉銹菌互作過程，適用于實時定量PCR分析的最穩(wěn)定的內(nèi)參基因GAPDH。
　　3、以GAPDH為內(nèi)參基因，利用實時定量PCR檢測表明TaEDS1在不親和組合互作早期表達(dá)量明顯增加。
　　4、構(gòu)建了TaEDS1亞細(xì)胞定位載體，利用基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察顯示TaEDS1定位于細(xì)胞核中。
　　5、構(gòu)建了TaEDS1VIGS載體，