TaCAMTA4在小麥與葉銹菌互作過程中的功能研究及其調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄組分析.pdf

1、本實驗室前期通過鈣離子的亞細(xì)胞定位和激發(fā)子刺激小麥懸浮細(xì)胞后胞質(zhì)Ca2+的濃度變化的研究等試驗已經(jīng)證明Ca2+/CaM信號參與了小麥與葉銹菌互作早期的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，并構(gòu)建了TaCaM4-1的誘餌載體，通過酵母雙雜交試驗從受葉銹菌侵染的小麥cDNA文庫中篩選出了TaCaM4-1下游互作蛋白的陽性克隆，TaCAMTA4就是其中之一。在此基礎(chǔ)上，利用5'-RACE PCR技術(shù)和序列拼接得到了TaCAMTA4基因的cDNA全長。CAMTA(Ca

2、lmodulin-bindingtranscription activator，鈣調(diào)素依賴的轉(zhuǎn)錄激活因子)又稱SR，是在進(jìn)化中高度保守的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在擬南芥中該家族共有6個成員，這六個轉(zhuǎn)錄因子可以共同調(diào)節(jié)與生物脅迫和非生物脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。通過前期的RT-qPCR試驗，對受葉銹菌侵染的小麥葉片進(jìn)行了TaCAMTA4基因的表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)不親和互作體系中，TaCAMTA4的表達(dá)量在接種后早期4-8 h呈下調(diào)趨勢，說明T

3、aCAMTA4在小麥與葉銹菌互作過程中可能發(fā)揮著負(fù)調(diào)控作用。
　　為了探究TaCAMTA4在小麥抗葉銹病過程中的作用，本試驗采用病毒(BSMV)誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)。首先進(jìn)行了VIGS試驗條件的優(yōu)化，然后構(gòu)建了TaCAMTA4基因序列中兩個不同片段的VIGS載體，并通過單獨和混合接種病毒比較這幾種情況下所引起的TaCAMTA4的沉默效率;并對基因沉默后葉銹菌在小麥葉片上的發(fā)育狀況進(jìn)行了觀察。在此基礎(chǔ)上，對基因沉默的L10

4、葉片于接菌(260)后不同時間點（前期:8h，12h;后期:20h，36h）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，以期找到與對照小麥葉片相比差異表達(dá)的基因，并獲得這些基因的注釋信息，初步分析了由TaCAMTA4調(diào)控的基因表達(dá)概況。
　　本試驗獲得的主要結(jié)果如下:
　　1.對在小麥L10上實施的VIGS實驗條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過構(gòu)建TaCAMTA4基因的兩個VIGS載體，并混合兩個病毒感染小麥，比較三者引起的沉默效率，確定了BSMV: TaCAM

5、TA4-2能夠更好的沉默目的基因。
　　2.在TaCAMTA4沉默的L10葉片上葉銹菌小種165的生長發(fā)育受到抑制，在熒光顯微鏡下觀察到菌絲團(tuán)的面積較對照組有所減小;葉片上的孢子堆面積也比對照組減小。
　　3.TaCAMTA4沉默的L10對葉銹菌260小種的抗性增強(qiáng)，發(fā)生HR的細(xì)胞面積有減小趨勢。
　　4.在TaCAMTA4沉默的L10葉片上接種葉銹菌小種260，以未經(jīng)沉默的材料做對照，在接種后不同時間點取樣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組

6、測序，總共產(chǎn)出24185102400 nt的數(shù)據(jù)，通過de novo組裝與拼接，得到72957條Unigene。
　　5.所有的Unigene中，共有60948條注釋到了NR，NT，Swiss-Prot，KEGG，COG，GO數(shù)據(jù)庫。
　　6.通過對差異基因的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)TaCAMTA4沉默的葉片與未發(fā)生該基因沉默的葉片相比，在葉銹菌侵染前期(8h，12h)有3456個基因上調(diào)表達(dá)，576個基因下調(diào)表達(dá);后期(20h，36

7、h)有4180個基因上調(diào)表達(dá)，633個基因下調(diào)表達(dá)。
　　7.通過RT-qPCR分析了5個小麥基因的表達(dá)量，驗證了RNA-Seq得到的數(shù)據(jù)是可靠的。
　　8.通過對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析和pathway分析，將這些基因進(jìn)行了GO和KEGG分類，初步證明TaCAMTA4調(diào)控了諸多生理過程，如代謝過程，刺激應(yīng)答過程，生物調(diào)節(jié)等;在調(diào)節(jié)自噬的pathway中，自噬關(guān)鍵基因TaATG8因TaCAMTA4沉默而上調(diào)表達(dá);植物與病原互