xa13基因在水稻—白葉枯病菌互作過(guò)程中的功能研究.pdf

1、水稻白葉枯病是由黃單胞桿菌水稻變種(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)引起，是水稻生產(chǎn)中的重要病害，每年造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。多年生產(chǎn)實(shí)踐表明，利用抗病基因資源，培育具有高效廣譜抗性的優(yōu)良品種是防治白葉枯病最經(jīng)濟(jì)有效的措施。對(duì)白葉枯病抗性基因機(jī)制和功能的深入研究，對(duì)利用主效抗病基因培育優(yōu)良品種有著重要的指導(dǎo)意義。
　　本研究從病原和寄主兩方面展開(kāi)工作，對(duì)病原菌研究發(fā)現(xiàn)在所有的白葉枯病原菌中，菲律賓菌系生

2、理小種6(PXO99)對(duì)銅離子最敏感。為了研究病原菌PXO99對(duì)銅敏感機(jī)制，構(gòu)建了抗銅病原菌PXO61的全基因組文庫(kù)，并導(dǎo)入到PXO99菌中，篩選抗銅突變體，對(duì)突變體測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)該區(qū)段含有兩個(gè)抗銅相關(guān)基因copA和copB。氨基酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)，PXO61與PXO99的copB基因編碼的氨基酸相同，而與PXO61的copA編碼區(qū)相比，PXO99的copA基因編碼區(qū)有六個(gè)氨基酸“DGTTQG”的缺失。將PXO99和PXO61的copA基因編碼區(qū)

3、進(jìn)行互換，證實(shí)PXO99對(duì)銅離子的敏感是由于copA基因編碼區(qū)的六個(gè)氨基酸“DGTTQG”缺失造成的。
　　為了研究copA和copB基因在病原菌中致病力的作用，將來(lái)自PXO61的copA和copB基因連接到pHMI載體上，并電轉(zhuǎn)化PXO99菌株中，得到16株耐銅的突變菌株，接種水稻感病品種IR4發(fā)現(xiàn)其致病力增強(qiáng)，而接種抗病品種IRBB13，不能打敗xa13介導(dǎo)的抗性。同時(shí)利用同源重組的原理，借助自殺性載體pK18mobsacB，

4、將PXO99小種的copA和copB基因同時(shí)突變，得到對(duì)銅離子更加敏感的copAB的突變體7株，分別接種IR24和IRBB13，與野生型PXO99相比，致病力有所下降，說(shuō)明copA和copB具有致病因子的功能。而抗銅突變體，不能使抗病品種完全恢復(fù)感病，說(shuō)明銅離子只是部分參與xa13介導(dǎo)的抗病，暗示了xa13還存在未知功能。
　　通過(guò)對(duì)水稻XA13蛋白家族同源性分析發(fā)現(xiàn)，OsXa13與來(lái)自禾本科作物玉米的同源基因(ZmXa13)同源

5、性最高，其在N-端（預(yù)測(cè)的跨膜區(qū)）的同源性高達(dá)90.5％，C-端的同源性為40.6％。通過(guò)酵母銅轉(zhuǎn)運(yùn)互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)OsXA13(1-220)可以和OsCOPT1和OsCOPT5形成三位一體的復(fù)合物，發(fā)揮其將銅從細(xì)胞外泵入細(xì)胞內(nèi)的功能。同時(shí)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明ZmXa13(56-100aa)第94位纈氨酸突變?yōu)楸彼嵊绊懫渑cOsCOPT5的互作。為進(jìn)一步探索OsXA13C端的作用，獲得PXa13:OsXA131-220、Pxa13:ZmXa

6、13、Pxa13:Nos-CzM、Pxa13:NzM-Cos四種轉(zhuǎn)基因植株，接種發(fā)現(xiàn)只有PXa13:Nos-CzM轉(zhuǎn)基因植株能夠恢復(fù)感病，說(shuō)明OsXa13的C端是感病所必需的并且功能保守。
　　為了解析Xa13C端功能和作用機(jī)制，利用酵母雙雜交的方法，篩選到兩個(gè)與XA13相互作用的蛋白CacyBP和HMG，通過(guò)酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，分別在體外和體內(nèi)證實(shí)XA13蛋白和CacyBP及HMG蛋白相互作用的真實(shí)性。同時(shí)，對(duì)Cac