小麥葉銹菌與TcLr19非親和互作EST分析及TaRLP19、TaSTKC8克隆與表達(dá).pdf

1、小麥?zhǔn)鞘澜绶秶鷥?nèi)的主要糧食作物之一。由小麥葉銹菌(Puccinia triticina)引起的小麥葉銹病是影響小麥穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的一類重要病害。該病在世界各產(chǎn)麥區(qū)均有發(fā)生,它的流行會(huì)造成嚴(yán)重的減產(chǎn)。培育抗病品種成為防治該病害最經(jīng)濟(jì)有效的方法。小麥抗葉銹病基因Lr19來源于長(zhǎng)穗偃麥草(Agropyron elongatum),是目前國(guó)內(nèi)外具有較大應(yīng)用潛力的抗葉銹病基因。本研究首先通過EST分析小麥葉銹菌與小麥TcLr19非親和互作的基因表達(dá)情況

2、;繼而以兩個(gè)TcLr19中特異表達(dá)的cDNA-AFLP片段為靶序列,通過cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)獲得其cDNA序列全長(zhǎng),并在接菌的TcLr19、Thatcher葉片中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.小麥TcLr19非親和cDNA文庫(kù)經(jīng)隨機(jī)測(cè)序,共獲得1512個(gè)有效ESTs,聚類拼接后得到948條非重復(fù)序列(unisequences),其中包括214個(gè)疊連群(contigs)和734個(gè)單拷貝(sin

3、glets)。Unigene基因進(jìn)行同源比對(duì)及COG分析表明,651條(68.67％)非重復(fù)序列與已知功能基因同源性很高,213條(22.49%)非重復(fù)序列與未知功能基因同源,10條(1.05%)序列與小麥葉銹菌同源,74條(7.81%)非重復(fù)序列尚無同源序列。EST分析表明,該文庫(kù)包括脂類、氨基酸、核苷酸、輔酶、碳水化合物、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝及光合作用相關(guān)基因等能量基礎(chǔ)代謝基因,抗病與防御類基因,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)類基因,信息存儲(chǔ)和加工類基因、

4、轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)基因及細(xì)胞骨架等。
　　 2.在功能已知的序列中,參與能量和基礎(chǔ)代謝類中,1,5.二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco),光系統(tǒng)Ⅱ10kd多肽蛋白,葉綠素a/b結(jié)合蛋白等參與光合作用及葉綠體結(jié)構(gòu)建成的基因出現(xiàn)的頻率都較高;在抗病與防衛(wèi)相關(guān)基因中,SGT1蛋白、類RPP-8蛋白、類14-3-3蛋白、HSP70/HSP90熱休克蛋白、抗病防御基因PR10蛋白、F-box蛋白、WIR1A蛋白、過氧化氫酶等基因均存在;

5、此外,一些與(非)生物脅迫有關(guān)的基因,如過敏性反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白、傷誘導(dǎo)蛋白、脅迫反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白、鐵缺乏誘導(dǎo)蛋白、冷脅迫蛋白等均存在;在膜和轉(zhuǎn)運(yùn)類基因中,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子、H+-ATP酶類等出現(xiàn)頻率較高;信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)類基因包括GTP蛋白、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、類受體蛋白激酶等。推測(cè)上述高頻率基因可能參與小麥與葉銹菌的非親和互作過程。該cDNA文庫(kù)為建立研究病原菌基因及小麥抗病基因數(shù)據(jù)庫(kù),克隆小麥抗葉銹病相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。
　　 3.以本課題組

6、前期通過cDNA-AFLP技術(shù)獲得一條在TcLr19和Tatcher與小麥葉銹菌互作時(shí)的差異表達(dá)片段19-9為靶序列,采用RACE技術(shù)在TcLr19中獲得了cDNA全長(zhǎng)為2545bp小麥抗病相關(guān)基因,并在接菌的TcLr19中驗(yàn)證得到該基因。該基因包含2136bp的開放閱讀框,編碼711個(gè)通讀的蛋白質(zhì)氨基酸序列,180bp的5’非翻譯區(qū)(non translated region,UTR),243bp的3’非翻譯區(qū)和31bp的多聚腺苷酸(

7、A)尾,暫命名為TaRLP19。TaRLPl9基因編碼產(chǎn)物具有胞外結(jié)構(gòu)域和單次跨膜區(qū),C末端胞內(nèi)域較短,不包括激酶域;胞外域含有6個(gè)富含亮氨酸基序(LRR),每個(gè)LRR序列大概含有23～24個(gè)氨基酸,符合典型單子葉植物所具有的LRR-TM結(jié)構(gòu)模式。在GenBank獲得的登錄號(hào)為JN872563。
　　 4.以前期研究利用cDNA-AFLP技術(shù)獲得的在TcLr19和Thatcher與小麥葉銹菌互作時(shí)的差異表達(dá)片段Sr-19為靶序列

8、,采用RACE技術(shù)在TcLr19中獲得了cDNA全長(zhǎng)為2062bp小麥抗病相關(guān)基因,該基因包含1363bp的開放閱讀框,編碼450個(gè)通讀的蛋白質(zhì)氨基酸序列,275bp的5’非翻譯區(qū),434bp的3’非翻譯區(qū)和27bp的多聚腺苷酸尾,暫命名為TaSTKC8。TaSTKC8基因編碼產(chǎn)物具有STK、MSP等保守結(jié)構(gòu)域。
　　 5.應(yīng)用熒光定量技術(shù)對(duì)未接菌和接菌不同時(shí)間點(diǎn)(Oh、6h、12h、18h、24h、36h、48h、60h、72

9、h、96h、120h)的TcLr19、Thatcher進(jìn)行分析,結(jié)果表明在接菌前以及接菌后120h內(nèi),TaRLP19、TaSTKC8基因在TcLr19和Thatcher中均有表達(dá),為組成型基因。TaRLP19基因在TcLr19接菌前后出現(xiàn)表達(dá)時(shí)間提前且表達(dá)量下調(diào)的現(xiàn)象;TaSTKC8在Tclr19接菌前后呈表達(dá)高峰提前且大部分時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量增高的現(xiàn)象,由此推測(cè)該基因受葉銹菌上調(diào)表達(dá),期間可能涉及特異基因的轉(zhuǎn)錄激活和HR及SAR反應(yīng)中新蛋