紅斑丹毒絲菌新型毒力相關(guān)因子鑒定及其耐喹諾酮藥物機(jī)制初探.pdf

1、紅斑丹毒絲菌感染豬導(dǎo)致豬丹毒，主要引起豬的敗血癥、心內(nèi)膜炎和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎。2010年以來，我國多個(gè)省份均出現(xiàn)了豬丹毒的大范圍流行，給豬場(chǎng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雖然紅斑丹毒絲菌成為嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病病原，但關(guān)于其致病機(jī)制和免疫機(jī)制的研究還相對(duì)滯后。紅斑丹毒絲菌的致病機(jī)制不明確成為防控豬丹毒最大的阻礙，新毒力（相關(guān)）因子及毒力調(diào)控基因的發(fā)掘以及功能研究是目前紅斑丹毒絲菌致病機(jī)理研究的關(guān)鍵。本研究力圖系統(tǒng)性發(fā)掘紅斑丹毒絲菌新的毒力（相關(guān)）

2、因子，為進(jìn)一步研究紅斑丹毒絲菌致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。鑒于革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁相關(guān)蛋白在細(xì)菌的粘附、侵入等致病過程中發(fā)揮重要作用，本研究以紅斑丹毒絲菌的細(xì)胞壁相關(guān)蛋白為研究對(duì)象，利用iTRAQ結(jié)合LC-MS/MS的方法鑒定了強(qiáng)弱毒菌株差異表達(dá)的細(xì)胞壁相關(guān)蛋白，并對(duì)鑒定到的潛在的毒力相關(guān)因子Sbp進(jìn)行了驗(yàn)證，評(píng)價(jià)了Sbp制備的亞單位疫苗對(duì)仔豬的免疫保護(hù)效果。
　　在90年代初期，我國通過疫苗免疫等防控手段，使得豬丹毒疫情得到控制。如今豬丹

3、毒這一“老病”新發(fā)，也提出了許多問題:是否現(xiàn)有疫苗預(yù)防不理想？或是臨床流行的紅斑丹毒絲菌耐藥性發(fā)生了變化？為了給當(dāng)前防控豬丹毒提供科學(xué)的用藥指導(dǎo)，本研究對(duì)紅斑丹毒絲菌臨床分離株進(jìn)行了21種常用藥物的耐藥譜檢測(cè)。并進(jìn)一步對(duì)紅斑丹毒絲菌耐喹諾酮藥物的機(jī)制進(jìn)行了初步探索。本研究的主要成果總結(jié)如下:
　　1.紅斑丹毒絲菌比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　本研究以紅斑丹毒絲菌的強(qiáng)毒菌株和弱毒菌株的細(xì)胞壁相關(guān)蛋白為研究對(duì)象，利用iTRAQ結(jié)合LC

4、-MS/MS的方法鑒定差異表達(dá)蛋白，共鑒定到100個(gè)差異表達(dá)的細(xì)胞壁相關(guān)蛋白。強(qiáng)毒菌株中高表達(dá)蛋白為57個(gè)，主要為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和粘附相關(guān)蛋白;低表達(dá)蛋白為43個(gè)，主要為壓力反應(yīng)蛋白。強(qiáng)毒菌株中高表達(dá)的蛋白可能跟細(xì)菌毒力相關(guān)，本研究選取強(qiáng)毒菌株中高表達(dá)的部分蛋白，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白，純化后免疫小鼠制備多克隆抗體，通過Western Blot檢測(cè)其在強(qiáng)弱毒菌株中的實(shí)際表達(dá)情況，其表達(dá)情況與iTRAQ結(jié)果一致。
　　對(duì)強(qiáng)毒菌

5、株高表達(dá)的蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sbp在強(qiáng)毒菌株中表達(dá)量為弱毒菌株的1.73倍。Sbp蛋白被報(bào)道參與細(xì)菌雙精氨酸轉(zhuǎn)位通路，是一些細(xì)菌重要的毒力因子。為了驗(yàn)證Sbp在紅斑丹毒絲菌致病過程中發(fā)揮的作用，本研究利用同源重組原理構(gòu)建了sbp基因缺失突變菌株。sbp基因缺失后，紅斑丹毒絲菌粘附侵入豬髖動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(PIEC)的能力顯著下降，其在健康豬全血中的存活率也顯著下降，同時(shí)其抵抗小鼠吞噬細(xì)胞吞噬的能力也降低。動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與野

6、生菌相比，sbp基因缺失菌株對(duì)豬的致病力下降。這些結(jié)果表明Sbp是紅斑丹毒絲菌重要的毒力相關(guān)因子。
　　同時(shí)，病原菌表面的毒力相關(guān)蛋白通常也是其重要的保護(hù)性抗原，所以本研究利用仔豬模型評(píng)價(jià)Sbp蛋白的保護(hù)效力。在本研究中，純化的重組Sbp蛋白能夠誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生高水平的抗體，并保護(hù)66.7％的仔豬抵抗致死劑量的紅斑丹毒絲菌人工感染?？贵w跟蹤檢測(cè)表明Sbp誘導(dǎo)的抗體可持續(xù)最少6個(gè)月。結(jié)果表明Sbp是一個(gè)有效的疫苗候選蛋白。
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7、.紅斑丹毒絲菌耐喹諾酮藥物機(jī)制初探
　　本研究用藥敏紙片法檢測(cè)了紅斑丹毒絲菌臨床分離株對(duì)21種常用藥物的耐藥譜，旨在了解當(dāng)前流行株的耐藥情況，為臨床用藥提供參考。進(jìn)一步利用E-test藥敏紙條檢測(cè)臨床分離株對(duì)環(huán)丙沙星和左旋氧氟沙星（喹諾酮類藥物）的MIC值，根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，判定臨床分離的紅斑丹毒絲菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率為48.8％，且不同菌株之間對(duì)環(huán)丙沙星藥物的MIC值呈現(xiàn)多樣性。進(jìn)一步通過測(cè)序分析喹諾酮耐藥相關(guān)基因DNA解旋酶（