氟喹諾酮藥物對結(jié)核分枝桿菌深層次作用機制研究.pdf

1、從科赫(RobertKoch)1882年確定結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)是結(jié)核病的致病菌以來，全球結(jié)核病疫情似乎只是得到短暫的遏制。世界衛(wèi)生組織預測2011年全球結(jié)核病新發(fā)病例為980萬，創(chuàng)歷年新高。嚴峻的疫情再次凸顯了抗結(jié)核治療手段的匱乏。盡管進行了長達半個世紀的化學治療，世界上仍有三分之一的人口為結(jié)核分枝桿菌潛伏感染人群。此外，潛伏感染結(jié)核菌的重新激活對于其他疾病也是一個高風險因素，尤其是HIV

2、病人以及糖尿病病人(進行抗腫瘤壞死因子治療的病人)等免疫缺陷的個體[2]。多耐藥以及廣泛耐藥結(jié)核病(Multiandextensivelydrugresistanttuberculosis，MDR-TBandXDRTB)的出現(xiàn)使結(jié)核病的疫情火上澆油，也使幾十年以來一直延續(xù)的抗結(jié)核療法更加捉襟見肘。
　　 一線抗結(jié)核藥物包括異煙肼(Isoniazid，INH)、利福平(Rifampicin，RIF)、比嗪酰胺(Pyrazinami

3、de，PZA)以及乙胺丁醇(Ethambutol，EMB)。多耐藥結(jié)核菌指至少同時對異煙肼和利福平耐藥的結(jié)核分枝桿菌。對MDR-TB的治療主要依靠二線抗結(jié)核藥物，主要有氨基糖苷類、多肽類、氟喹諾酮類等。氟喹諾酮藥物因其低毒副作用以及充足的衍生物庫而尤為受到重視。新一代氟喹諾酮藥物莫西沙星和加替沙星與一線抗結(jié)核藥物聯(lián)用縮短結(jié)核病治療時長的Ⅲ期臨床試驗也在進行中，這進一步提示氟喹諾酮藥物在抗擊結(jié)核病中的重要作用。
　　 氟喹諾酮藥物

4、主要靶向細菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ。結(jié)核分枝桿菌中只有DNA旋轉(zhuǎn)酶，該酶為氟喹諾酮藥物的唯一靶點。結(jié)核分枝桿菌耐受氟喹諾酮藥物主要也是因為DNA旋轉(zhuǎn)酶相關(guān)區(qū)域的突變造成的。近年來，不同國家或地區(qū)的結(jié)核分枝桿菌耐受氟喹諾酮藥物的分子特征被陸續(xù)報道，但這些研究所采用的樣本量小，具有明顯的地域局限性。為了解中國大陸地區(qū)的氟喹諾酮耐受的結(jié)核分枝桿菌的分子機理，我們收集了來自中國大陸各地的氟喹諾酮耐受的結(jié)核分枝桿菌臨床菌株，對氟喹諾酮耐受決

5、定區(qū)進行擴展測序，發(fā)現(xiàn)了若干新氟喹諾酮耐受相關(guān)位點和突變類型(GyrB：Glu498及Gly551，GyrA：Asp94Asn-Gly112His，GyrB：Thr539Asn-Gly551Arg)，可以為結(jié)核分枝桿菌藥敏芯片提供設(shè)計依據(jù)；采用數(shù)學方法對不同突變類型進行評價，確定了結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐受決定區(qū)中不同突變位點或者突變類型對耐藥性的貢獻，得到的結(jié)果提示該區(qū)域的雙重突變與高水平藥物耐受的相關(guān)性，提醒對氟喹諾酮藥物的合理使用尤

6、為重要。結(jié)合得到的氟喹諾酮藥物的耐藥位點，我們優(yōu)化了氟喹諾酮藥物作用于結(jié)核分枝桿菌DNA旋轉(zhuǎn)酶結(jié)構(gòu)學特征，為新型氟喹諾酮藥物的開發(fā)提供支持。本研究中第一次對氧氟沙星和左氧氟沙星對多耐藥結(jié)核分枝桿菌的殺傷效果進行了評價。到目前為止，該研究是樣本量最大(177例)，地域來源(中國大陸)最為廣泛的結(jié)核分枝桿菌耐受喹諾酮藥物分子特征的調(diào)查。
　　 在細菌自身進化史中，會發(fā)展一系列的抵御外界環(huán)境壓力的武器，這類環(huán)境壓力也包括抗生素壓力。細

7、菌抵御抗生素的機制包括藥物代謝相關(guān)酶、藥物外排系統(tǒng)以及靶點修飾相關(guān)基因等。目前開發(fā)新的抗癆藥物進展緩慢，故我們嘗試尋找分枝桿菌屬細菌抵御氟喹諾酮藥物的本底機制，將相關(guān)基因作為潛在的氟喹諾酮藥物增效劑靶點。通過構(gòu)建分枝桿菌突變庫，篩選獲得了對氟喹諾酮藥物-莫西沙星超敏感的突變菌株，完成插入位點的鑒定以及功能驗證，確定了若干分枝桿菌抵御氟喹諾酮藥物基因。所獲得的基因可以作為氟喹諾酮藥物增效劑開發(fā)靶點，篩選獲得的化合物可以與氟喹諾酮藥物聯(lián)用，

8、提高氟喹諾酮藥物使用效率，延長藥物使用壽命。
　　 雖然喹諾酮藥物靶點明確，不同喹諾酮藥物殺傷細菌的特征迥異。主要以喹諾酮藥物的殺菌作用是否受蛋白合成抑制劑氯霉素所抑制以及殺菌作用是否在低氧條件下消失來區(qū)分。不同喹諾酮藥物在氯霉素和厭氧條件下的殺傷效果顯著的不同。第一代化合物，比如萘啶酸(nalidixic)和奧索利酸(oxolinicacids)在氯霉素處理或者低氧條件下無致死活性，而第二代藥物比如諾氟沙星(norfloxac

9、in)雖在氯霉素存在情況下無殺傷活性，但其在高濃度下，卻可以在低氧條件下殺傷細菌。第三代喹諾酮藥物環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)，可以在氯霉素存在或者低氧條件下殺傷細菌(低氧條件下的殺菌作用需要高濃度藥物)；第四代C-8-甲氧基衍生物莫西沙星(moxifloxacin)的殺傷作用幾乎不受氯霉素或者低氧條件的影響。這說明不同喹諾酮藥物通過不同的途徑完成對細菌的殺傷作用。前期研究證實喹諾酮的致死效應分兩步進行，第一階段是DNA-解旋

10、酶-喹諾酮藥物形成斷裂復合體，該復合體的形成會阻止細菌DNA的復制，導致次級殺傷作用的出現(xiàn)；第二階段是斷裂DNA從斷裂復合體中釋放出來，形成大量的染色體碎片，導致細菌快速死亡?？焖贇缘姆Z酮藥物比如莫西沙星的殺菌作用，可能是通過迅速破壞斷裂復合體來實現(xiàn)的。研究者猜測細菌本身一些分子可能作為“自殺分子”參與破壞染色體復合體的功能，釋放出斷裂DNA，導致細菌快速死亡。我們通過實驗首次證實：使用氯霉素阻止蛋白合成依賴性殺菌通路后，恥垢分

11、枝桿菌RuvAB缺失菌株，可以明顯的抵御莫西沙星的殺菌作用，這直接證明了RuvAB在非依賴蛋白質(zhì)合成殺菌途徑中的重要作用。
　　 在實驗室直接使用結(jié)核分枝桿菌進行實驗存在諸多的困難。首先，結(jié)核分枝桿菌菌屬于3類人體致病菌，需要在3級生物安全實驗室及相應動物設(shè)施中進行實驗；其次，結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，在液體培養(yǎng)基中倍增時間長達22小時，菌落的形成需要2-3個星期，導致實驗時間花費巨大。故很多實驗室采用其他一些分枝桿菌模型來研究結(jié)核

12、分枝桿菌的致病機制。恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)和結(jié)核病的致病菌-結(jié)核分枝桿菌(Mycobactreiumtuberculosis)同為分枝桿菌屬細菌，其生長快，無生物危害性，被廣泛的用于結(jié)核分枝桿菌致病機制、結(jié)核菌疫苗、結(jié)核菌藥物等方面的替代替代研究。為了更好的理解恥垢分枝桿菌模型在結(jié)核分枝桿菌替代研究中的替代性，我們使用系列的比較基因組學手段對恥垢分枝桿菌模型基因組進行了分析，發(fā)現(xiàn)恥垢分枝桿菌和結(jié)核分