香港海鷗型菌喹諾酮耐藥的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　香港海鷗型菌(Laribacter hongkongensis,LH)是2001年于香港首次發(fā)現(xiàn)的一種食源性致病菌,該菌主要引起社區(qū)性胃腸炎和旅行者腹瀉。在早期對(duì)香港海鷗型菌進(jìn)行耐藥性研究時(shí)未發(fā)現(xiàn)其對(duì)喹諾酮類抗菌藥物耐藥,故有研究學(xué)者推薦喹諾酮類藥物作為治療該菌感染的首選藥物之一。然而隨著抗菌藥物濫用的持續(xù)存在,近幾年香港海鷗型菌開始出現(xiàn)對(duì)喹諾酮耐藥的情況,且耐藥性有逐步加重的趨勢(shì),但其對(duì)喹諾酮的分子耐藥機(jī)制則不甚明了

2、。本研究從草魚和虎紋蛙中分離出香港海鷗型菌,并從這些分離株中篩選出喹諾酮耐藥株。對(duì)篩選得到的喹諾酮耐藥株進(jìn)行藥物靶位基因、外排泵作用和質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因的檢測(cè)和分析,以期全面了解香港海鷗型菌對(duì)喹諾酮類耐藥的分子機(jī)制,為該菌感染者抗菌治療的用藥選擇提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　方法：
　　1.香港海鷗型菌的分離和對(duì)喹諾酮類藥物的敏感性測(cè)定
　　在2011年3月至9月期間,從廣州7個(gè)不同的菜市場(chǎng)采集新鮮宰殺的草魚和虎紋蛙的腸

3、道標(biāo)本,采用選擇性培養(yǎng)基分離、生化鑒定和16SrRNA基因分子鑒定的方法分離出香港海鷗型菌菌株。采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定香港海鷗型菌各分離株對(duì)5種常見喹諾酮類藥物(萘啶酮酸、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星和左氧氟沙星)的耐藥情況,同時(shí)采用瓊脂稀釋法測(cè)定各分離株對(duì)萘啶酮酸和環(huán)丙沙星的最低抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC),篩選出在這兩種方法中均對(duì)環(huán)丙沙星耐藥的香港海鷗型菌菌株作為喹諾酮分子耐藥機(jī)制

4、的研究對(duì)象。
　　2.耐環(huán)丙沙星香港海鷗型菌藥物靶位基因突變的檢測(cè)和分析
　　用普通PCR的方法擴(kuò)增香港海鷗型菌環(huán)丙沙星耐藥株和部分敏感株中的兩個(gè)藥物靶位基因--gyrA和parC基因的喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistance-determining region,QRDR),并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與香港海鷗型菌中已知的gyrA和parC基因序列進(jìn)行比對(duì),找出耐藥株中喹諾酮耐藥決定區(qū)存在的突變位點(diǎn)

5、,并分析這些突變位點(diǎn)與其耐藥表型之間的關(guān)系。敏感株的測(cè)序結(jié)果用于對(duì)比分析。
　　3.耐環(huán)丙沙星香港海鷗型菌中主動(dòng)外排泵作用的檢測(cè)和分析
　　采用外排泵抑制劑氰氯苯腙(CCCP)與環(huán)丙沙星(CIP)聯(lián)合應(yīng)用的方法檢測(cè)香港海鷗型菌環(huán)丙沙星耐藥株的外排泵表型,分析耐藥株中是否存在外排泵作用機(jī)制。
　　4.耐環(huán)丙沙星香港海鷗型菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因的檢測(cè)和分析
　　用多重PCR的方法對(duì)香港海鷗型菌環(huán)丙沙星耐藥株進(jìn)行

6、質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因(qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、aac(6’)-Ib-cr和qepA基因)的檢測(cè),并將檢測(cè)結(jié)果與其耐藥性表現(xiàn)結(jié)合進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　1.本文從廣州7個(gè)不同的菜市場(chǎng)共采集了614份草魚和虎紋蛙腸道標(biāo)本,其中草魚魚腸443份,虎紋蛙腸道標(biāo)本171份。從614份腸道標(biāo)本中共分離出157株香港海鷗型菌,其中82株分離自草魚魚腸,75株分離自虎紋蛙腸道標(biāo)本,兩者的分離率分別為18.5

7、1％(82/443)和43.86%(75/171)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn),香港海鷗型菌蛙株的分離率顯著高于魚株的分離率(χ2=41.66,P<0.001)。
　　2.(1)157株香港海鷗型菌對(duì)5種常見喹諾酮類抗生素耐藥率從高到低依次為:萘啶酮酸40.76%(64/157)、諾氟沙星16.56%(26/157)、環(huán)丙沙星15.29%(24/157)、恩諾沙星8.28%(13/157)和左氧氟沙星3.82%(6/157)。
　　

8、(2)香港海鷗型菌魚分離株只對(duì)萘啶酮酸耐藥,耐藥率為13.41%(11/82);所有魚分離株均對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星和左氧氟沙星敏感。而蛙分離株對(duì)5種喹諾酮類藥物表現(xiàn)出不同程度的耐藥性,對(duì)萘啶酮酸、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別為70.67%(53/75)、32%(24/75)、17.33%(13/75)、34.67%(26/75)和8%(6/75)。
　　(3)157株香港海鷗型菌萘啶酮酸和環(huán)丙沙星

9、的MIC50分別為32μg/ml和0.25μg/ml。
　　3.(1)從157株香港海鷗型菌中檢測(cè)出環(huán)丙沙星耐藥株21株,其中有19株發(fā)生gyrA基因突變,突變率為90.47%;18株發(fā)生parC基因突變,突變率為85.71%。gyrA基因以雙位點(diǎn)突變?yōu)橹?其中有9株發(fā)生T85I+D89N突變,有6株發(fā)生T85I+D89G突變;15株gyrA基因雙位點(diǎn)突變耐藥株對(duì)環(huán)丙沙星的MIC50和MIC90均為32μg/ml,4株gyrA基因

10、單位點(diǎn)突變耐藥株對(duì)環(huán)丙沙星的MIC50和MIC90也均為32μg/ml。parC基因發(fā)生S83R+R231C雙位點(diǎn)突變的有9株,發(fā)生S83R單個(gè)位點(diǎn)突變的也有9株。90.48%的耐藥株(19/21)gyrA和parC基因中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上突變位點(diǎn)。有兩株耐藥株(W66和W68)的gyrA和parC基因均沒有發(fā)生突變。
　　(2)在CCCP濃度為0.1μg/ml條件下,21株環(huán)丙沙星耐藥株外排泵表型檢測(cè)結(jié)果均為陰性。
　　(

11、3)常見質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因在21株對(duì)環(huán)丙沙星耐藥的香港海鷗型菌中只檢測(cè)出aac(6')-Ib-cr基因,其他的PMQR基因(qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、qnrD和qepA)均未檢測(cè)出。aac(6')-Ib基因陽性株有11株,陽性率為52.38%(11/21);而aac(6')-Ib基因陽性株中有9株發(fā)生aac(6')-Ib-cr基因突變,突變率高達(dá)81.82%(9/11)。
　　結(jié)論：
　　1.香港海鷗型菌

12、能從淡水草魚和虎紋蛙中分離得到,且虎紋蛙中香港海鷗型菌的分離率高于草魚中的分離率。
　　2.在所檢測(cè)的5種喹諾酮類抗菌藥物中,香港海鷗型菌分離株對(duì)萘啶酮酸耐藥率最高,對(duì)左氧氟沙星耐藥率最低。魚分離株和蛙分離株的耐藥譜不同,蛙分離株對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥情況比魚分離株嚴(yán)重。
　　3.香港海鷗型菌對(duì)喹諾酮類藥物耐藥的主要機(jī)制是靶位基因gyrA和parC基因多位點(diǎn)突變,gyrA基因的主要突變位點(diǎn)是T85I、D89N和D89G,而pa