瓦布貝母抑菌活性菌株的篩選鑒定及其次生代謝產(chǎn)物的初步研究.pdf

1、植物內(nèi)生真菌是一類存在于宿主植物組織內(nèi)，卻又不引起植物病害的微生物，它們在長期的共同進(jìn)化過程中與宿主形成了趨于穩(wěn)定的互惠共生關(guān)系。植物內(nèi)生真菌是具有高度多樣性的微生物資源，能產(chǎn)生多種不同藥效價值的次生代謝活性產(chǎn)物，是一類具備良好開發(fā)價值的微生物，可作為抗菌、抗氧化及抗癌等天然藥物的潛在來源。由于內(nèi)生真菌具備抗菌活性，有望成為微生物農(nóng)藥制劑的重要來源，這對于農(nóng)業(yè)病蟲害的生物防治也將產(chǎn)生重要意義。本文以瓦布貝母內(nèi)生真菌作為研究對象，對菌株及

2、其次生代謝產(chǎn)物的抑菌活性進(jìn)行了篩選，并對具有高效廣譜抑菌活性的內(nèi)生真菌菌株進(jìn)行了菌種鑒定和發(fā)酵條件的優(yōu)化。主要研究結(jié)果包括以下幾個方面:
　　1、對分離自瓦布貝母鱗莖的50株內(nèi)生真菌進(jìn)行了抑菌活性的多重篩選。首先運用菌餅法，將4種指示細(xì)菌（革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌）和1種指示真菌作為指示菌，對50株內(nèi)生真菌進(jìn)行了抑菌活性的初篩，其中有41株內(nèi)生真菌對一種以上指示菌具有抑制作用，占菌株總數(shù)的82.00％;有23株內(nèi)生真菌對三種以上指

3、示菌具有抑制作用，占菌株總數(shù)的46.00％。
　　采用雙層平板法，將上述試驗中對三種以上指示菌具有抑制作用的23株內(nèi)生真菌進(jìn)行抑菌活性的復(fù)篩。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有15株內(nèi)生真菌對一種以上指示菌有顯著抑菌活性，占總菌株的比例為65.22％; WBS001、WBS002、WBS008和7WBY2分別對四種指示菌均具有較強(qiáng)的抑制活性。
　　采用平皿打孔法，將復(fù)篩時發(fā)現(xiàn)的對兩種以上指示菌具有抑制作用或?qū)σ环N指示菌具有顯著抑制作用（W21和1

4、WBY2）的10株內(nèi)生真菌，采用供試植物病原真菌作為指示菌進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對一種及以上病原真菌有顯著抑菌活性的內(nèi)生真菌有8株，占總菌株的比例為80.00％。其中對玉米小斑病菌的抑制率，菌株WBS008高達(dá)57.35％、WBS002高達(dá)50.00％，WBS001對核盤菌的抑制率也高達(dá)52.44％。
　　再將上述試驗中對四種及以上植物病原真菌具有顯著抑制作用的菌株(WBS001、WBS002、WBS008)，擴(kuò)大植物病原菌

5、種類和數(shù)量，運用相同的平皿打孔法進(jìn)行抑菌試驗。結(jié)果表明，以上3株內(nèi)生真菌菌株均分別對三種及以上病原真菌具有顯著抑菌活性。
　　2、將最終篩選出的3株具有廣譜抑菌活性的菌株進(jìn)行活性部位的篩選，以確定抑菌活性成分所分布的極性部位。結(jié)果顯示菌株WBS001和WBS008在乙酸乙酯相中具有最高的抑菌活性，而WBS002則在石油醚相中具有最高的抑菌活性。
　　3、采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法，對活性菌株WBS001、WBS002進(jìn)行了鑒

6、定。結(jié)果顯示W(wǎng)BS001菌株為曲霉屬(Aspergillus)的煙曲霉原變種(Aspergillus fumigates)，WBS002菌株為炭疽刺盤孢菌屬(Colletotrichum)的炭疽刺盤孢菌(colletotrichumcircinans)。
　　4、對抑菌活性菌株WBS008進(jìn)行了發(fā)酵條件的優(yōu)化，初步建立了該菌株穩(wěn)定分泌抑菌活性成分的發(fā)酵體系，即最佳接種量為10％，最適培養(yǎng)溫度為28℃，最適pH值為8.0，培養(yǎng)6d時