海洋抑菌放線菌的篩選、鑒定及其抑菌活性物質研究.pdf

1、隨著抗生素的大量使用，病原菌耐藥性逐漸增強。因此，新型生物活性物質的持續(xù)開發(fā)以應對病原菌耐藥性增強的速度成為當前醫(yī)藥界的迫切需要。海洋微生物資源豐富，環(huán)境獨特使得海洋微生物能夠產生許多結構新穎的生物活性物質。放線菌是產生生物活性物質的主要產生菌，從海洋中篩選產生物活性物質的海洋放線菌是近年來研究熱點，且很多新型海洋生物活性物質具備良好的應用前景。本研究從東海海泥樣品中篩選出一株抑菌譜廣、抑菌活性強的海洋放線菌，并對其進行了鑒定；研究了抑

2、菌物質的理化性質；優(yōu)化了該菌的發(fā)酵培養(yǎng)基；并初步研究了該菌對單核細胞增生李斯特菌ATCC19114的作用機理。具體內容如下：
　　1.海洋抑菌放線菌的篩選與鑒定
　　采用瓊脂塊法初篩，打孔擴散法復篩從東海海泥樣品中篩選出12株具有抑菌活性的海洋放線菌，其中 Y10、Y11、Y15、Y16和 Y21具有較強的抑菌性，且Y15在四種發(fā)酵培養(yǎng)基中均能產生抑菌活性物質。通過抑菌譜分析表明Y15抑菌譜最廣，對20株指示菌中的18株表現(xiàn)

3、出抑菌作用，尤其對單核細胞增生李斯特菌,金黃色葡萄球菌，維氏氣單胞菌抑菌作用極強，因此被確定為目標菌。通過形態(tài)學觀察和16S rRNA基因序列同源性分析鑒定菌株Y15屬于小單孢菌屬，獲得GenBank登錄號為：KU517850。
　　2. Y15抑菌物質性質研究
　　研究了Y15抑菌物質的產生隨時間變化關系曲線和Y15傳代穩(wěn)定性。對Y15抑菌物質溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、紫外穩(wěn)定性、酶水解穩(wěn)定性和極性大小進行了分析。Y15在1

4、48 h抑菌活性最大，達到480 AU/mL，在168-216 h保持平衡為320 AU/mL，在48-216 h為生長對數(shù)期，在216-288 h為生長穩(wěn)定期。Y15傳代穩(wěn)定性較好，在第1代到第7代菌體保持穩(wěn)定。Y15抑菌活性物質在-20-60℃抑菌活性保持穩(wěn)定，在80-120℃活性逐漸下降。Y15抑菌活性物質在pH7.0-10.0之間保持穩(wěn)定的抑菌活性，在酸性和強堿性條件下抑菌活性均下降。Y15抑菌物質具有良好的紫外穩(wěn)定性。抑菌物質

5、對四種酶水解作用下保持穩(wěn)定，表明Y15抑菌物質為非蛋白和多肽類物質。Y15抑菌物質被乙酸乙酯萃取的效果最佳，濃縮之后活性可達5200 AU/mL，表明抑菌物質具有中等極性。
　　3. Y15發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化
　　通過單因素實驗優(yōu)化了Y15發(fā)酵培養(yǎng)條件，利用響應面法優(yōu)化了Y15發(fā)酵培養(yǎng)基成分。確定最優(yōu)培養(yǎng)條件為溫度30℃，培養(yǎng)基初始pH為7.20，接種量為4％，搖床轉速為180 rpm。單因素實驗選擇可溶性淀粉、牛肉膏、胰蛋白胨

6、、NaCl、K2HPO4、MgSO4和FeSO4為影響因子；通過Plackett-Burman實驗確定影響抑菌活性物質產生的顯著因素為K2HPO4、可溶性淀粉和牛肉膏；最陡爬坡實驗確定中心點為：K2HPO4為1.00 g/L，可溶性淀粉為25.00 g/L，牛肉膏為18.00 g/L；CCD實驗確定最佳培養(yǎng)基配方為：K2HPO4為1.03 g/L，可溶性淀粉為27.67 g/L，牛肉膏為18.30g/L，胰蛋白胨為7.50 g/L，F(xiàn)e

7、SO4為0.02 g/L，NaCl為0.38 g/L，MgSO4為0.75 g/L，在此濃度水平下預測最大抑菌活性為1174.63 AU/mL。驗證性實驗測得的實際抑菌活性為1236.79±14.56 AU/mL，與預測值無顯著差異，相比于優(yōu)化前抑菌活性提高了3.86倍。
　　4. Y15抑菌活性物質抑菌機理初步研究
　　探討了Y15抑菌物質抑制單核細胞增生李斯特菌ATCC19114的作用機理。結果表明 Y15抑菌物質對指示

8、菌生長曲線具有顯著影響；對細胞壁無損傷作用；胞內離子發(fā)生泄露，而大分子物質沒有泄露，推斷對細胞膜損傷不大；掃描電鏡下，經 Y15抑菌物質處理的指示菌細胞形態(tài)發(fā)生皺縮、彎曲，但并未導致細胞裂解，證實上述推斷。另一方面，Y15抑菌物質對指示菌DNA并無影響，但會使指示菌可溶性蛋白表達量減少，推斷 Y15的作用機理可能是通過影響指示菌胞內可溶性蛋白表達和改變細胞膜通透性使指示菌的生長受到抑制甚至死亡，具體機理有待進一步研究。
　　小單孢

9、菌是稀有放線菌，且小單孢菌菌產生的生物活性物質僅次于鏈霉菌，具有重要開發(fā)價值。Y15與M.endolithica具有很高的相似度，M.endolithica是一株小單孢菌菌新種，目前發(fā)現(xiàn)的該菌并未有抑菌活性的報道，Y15卻具有極好的抑菌性。Y15抑菌譜廣，對水產品病原菌如L. monocytogenes,S. aureus,A. veronii和V. parahaemolyticus均具有極強的抑菌性，因此Y15在水產品病原菌防治中也具