抑菌內(nèi)生真菌的分離及人參內(nèi)生菌抑菌活性物質(zhì)初步研究.pdf

1、植物內(nèi)生真菌是在植物體內(nèi)渡過全部或部分生活周期，而不使宿主植物表現(xiàn)出明顯的病害癥狀的真菌?，F(xiàn)已有報(bào)道表明，由藥用植物中分離得到的內(nèi)生真菌，能夠產(chǎn)生與其宿主植物相同或相似的化學(xué)成分。本研究對(duì)幾種具有抑菌作用藥用植物的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，并對(duì)其代謝產(chǎn)物的抑菌活性進(jìn)行篩選。對(duì)其中具有較強(qiáng)抑菌活性的人參內(nèi)生真菌RP進(jìn)行了更進(jìn)一步的研究。對(duì)菌株RP生物學(xué)特性、各種培養(yǎng)條件對(duì)抑菌物質(zhì)的影響進(jìn)行了研究，并通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)該菌株進(jìn)行了屬種鑒定

2、。同時(shí)對(duì)該菌株抑菌活性成分進(jìn)行初步的分離和鑒定研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.采用組織塊分離法，以PDA、CMA、MEA、HMA和TWA培養(yǎng)基為內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)基，在20℃下避光培養(yǎng)，對(duì)內(nèi)生菌進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以組織塊印跡法對(duì)組織塊表面消毒效果進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果更加可靠，更靈敏。由12種藥用植物的莖和葉及花序中分離得到48株內(nèi)生真菌。其中莖內(nèi)分離得到20株，葉內(nèi)分離得到19株，花中分離得到9株。PDA-鏈霉素培養(yǎng)基為較適宜的分離培養(yǎng)基。

3、 2.對(duì)48株分離得到的內(nèi)生真菌的菌塊、發(fā)酵液和菌絲醇提液的抑菌活性分別進(jìn)行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人參、黃芩、黃芪和柴胡4種藥用植物中分離得到的內(nèi)生真菌的菌塊、發(fā)酵液和菌絲醇提液3部分均具有抑菌活性，其中又以人參內(nèi)生真菌RP的抑菌活性最強(qiáng)，并且對(duì)幾種測(cè)試菌均有一定的抑菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌的相對(duì)抑制率最高達(dá)到76％。選擇活性菌株人參內(nèi)生真菌RP進(jìn)行更深入的研究。 3.抑菌活性菌株人參內(nèi)生真菌RP在培養(yǎng)時(shí)的較適宜C源為大米，N源為

4、酵母；最適宜的培養(yǎng)溫度為24℃，培養(yǎng)到25天時(shí)，活性物質(zhì)產(chǎn)生達(dá)到最高值。該菌對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)為8gg/mL。通過形態(tài)學(xué)鑒定該菌株為Phomopsis.sp，5.8SrDNA的PCR測(cè)序結(jié)果顯示，序列長為539bp，該菌株與Preussia flnaganii序列同源性為99％。但他們?cè)谛螒B(tài)上卻有很大不同，這需要通過結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的對(duì)比進(jìn)一步的研究。 4.對(duì)菌株RP的活性成分進(jìn)行了初步的研究。采用大

5、孔樹脂柱的方法找到抑菌活性物質(zhì)的存在部位。發(fā)現(xiàn)大部分的活性物質(zhì)溶于80％-90％的乙醇溶液中。而在80％-90％乙醇溶液收集到的洗脫液中，檢測(cè)到了有皂甙類成分存在，并對(duì)其中的皂甙類成分通過薄層層析法(TLC)進(jìn)行了初步鑒定，結(jié)果在Rf值分別為Rf<,1>=0.3974，Rf<,2>=0.5128，Rf<,3>=0.8846時(shí)分離得到了3個(gè)點(diǎn)。其中，Rf值為0.3974的點(diǎn)與人參皂甙Re的Rf值相同，說明在菌株RP的發(fā)酵液中可能含有人參皂