具有抑菌活性的桑樹內(nèi)生菌的分離鑒定及其抑菌物質(zhì)研究.pdf

1、植物內(nèi)生菌是一個(gè)多樣性豐富而復(fù)雜的微生物類群。研究發(fā)現(xiàn),植物中內(nèi)生菌可產(chǎn)生抗腫瘤、抑菌和殺蟲等生物活性物質(zhì),是開發(fā)新天然藥物的潛在來(lái)源。
　　本文中,以大腸桿菌為指示菌,從魯桑桑枝組織中分離具有抑菌活性的內(nèi)生菌,并通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定;在單因素的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)曲面分析法對(duì)該菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化;通過(guò)乙酸乙酯萃取和硅膠層析等方法分離純化該菌株發(fā)酵產(chǎn)物中的抑菌物質(zhì),并利用氣相-質(zhì)譜分析

2、儀對(duì)抑菌物質(zhì)的進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析;通過(guò)紫外光譜、紅外光譜和透射電鏡等方法對(duì)該菌株的抑菌機(jī)理進(jìn)行初步研究。取得以下研究結(jié)果:
　　從魯桑桑枝組織中分離得到75株內(nèi)生菌,其中,內(nèi)生真菌49株,內(nèi)生細(xì)菌26株;篩選出2株具有抑菌活性的內(nèi)生菌ME1和ME2。形態(tài)學(xué)和生理生化特征表明:菌株 ME1是具有鞭毛和芽孢,無(wú)莢膜的革蘭氏陽(yáng)性菌,細(xì)胞呈桿狀,大小0.6～0.7μm×1.8～1.9μm;能夠利用葡萄糖、蔗糖、乳糖和淀粉,不能利用酪蛋白;菌株M

3、E2是具有鞭毛和芽孢,無(wú)莢膜的革蘭氏陽(yáng)性菌,細(xì)胞呈桿狀,大小0.6～0.7μm×1.5～1.6μm;能夠利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉和酪蛋白。依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》,初步鑒定菌株ME1和ME2為芽孢桿菌。通過(guò)16S rRNA基因序列分析,最終鑒定菌株 ME1(GenBank登錄號(hào):JQ900635)和ME2(GenBank登錄號(hào):JQ900623)為Bacillus subtilis。
　　本文中,響應(yīng)

4、曲面分析法優(yōu)化出菌株 ME1的最優(yōu)培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯浸提物6.04 g/L、葡萄糖30.80 g/L、硝酸銨10.20 g/L、氯化鈣19.80 g/L;最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)為:接種量2％,裝液量50％,培養(yǎng)基初始pH7.08,發(fā)酵時(shí)間72 h,發(fā)酵溫度27.9℃,轉(zhuǎn)速152 r/min。在此條件下,ME1菌株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的抑制圈直徑為24.27 mm。
　　氣相-質(zhì)譜分析結(jié)果表明:菌株ME1發(fā)酵產(chǎn)物中主要存在(2,5-二甲基-1

5、-對(duì)氯苯基-3-亞甲基)-N-(5-異喹啉基)胺、3,6-二丁基-1,2-二氫-1,2,4,5-四嗪、4,4a,5,6,7,8,9,9a-八氫-10,10-1,4-甲醇-1H-環(huán)庚烷[d]噠嗪、壬二酸-二(2-甲基丙基)酯和2,4-二[P–氯苯乙烯基]-5-硝基噻唑等具有抑菌活性的化合物。
　　菌株ME1的發(fā)酵液粗提物(Extr.01)能夠抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在對(duì)數(shù)期中的生長(zhǎng);通過(guò)對(duì)指示菌(大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)培養(yǎng)液