竹蓀中抑菌物質(zhì)的提取方法優(yōu)化及其抑菌機(jī)理的初步探究.pdf

1、竹蓀是一種常見(jiàn)真菌,長(zhǎng)期以來(lái)作為典型的功能性食品而存在。目前分布在我國(guó)的竹蓀主要有7種,其中長(zhǎng)裙竹蓀與棘托竹蓀都具有很強(qiáng)的食藥用價(jià)值,已在我國(guó)西南地區(qū)得到廣泛栽培。隨著國(guó)內(nèi)對(duì)天然產(chǎn)物研究的興起,對(duì)竹蓀的生物活性、功能成分、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等的研究現(xiàn)已成為當(dāng)前科研領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
　　本研究是上海市教委創(chuàng)新項(xiàng)目“竹蓀抑菌活性物質(zhì)的提取及其抑菌作用的研究(11YZ159)”中的一部分。主要以竹蓀子實(shí)體為原料,通過(guò)超臨界CO2萃取技術(shù)對(duì)抑菌物質(zhì)

2、的提取方法進(jìn)行優(yōu)化,以微量肉湯稀釋法對(duì)竹蓀通過(guò)多類提取方法所得物質(zhì)的抑菌效果作系統(tǒng)測(cè)定,同時(shí)進(jìn)行比較分析,并對(duì)竹蓀提取物的抑菌機(jī)理和應(yīng)用作初步研究。
　　首先,選擇單增李斯特菌,金黃色葡萄球菌,副溶血性弧菌,大腸桿菌,熒光假單胞菌,植物乳桿菌作為供試菌種,通過(guò)微量肉湯稀釋法測(cè)定四種提取方法提取棘托竹蓀和長(zhǎng)裙竹蓀所得物質(zhì)的最小抑菌濃度,并將各提取方法的效果加以比較,篩選出抑菌效果最佳的提取方法。同時(shí),將微量肉湯稀釋法與平板計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)

3、行比較,對(duì)其測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:棘托竹蓀與長(zhǎng)裙竹蓀通過(guò)的四種提取方法所得的物質(zhì)均具有抑菌作用,其中,水蒸氣蒸餾法所得揮發(fā)油的抑菌效果遠(yuǎn)優(yōu)于三種有機(jī)溶劑提取物,其MIC值為31.2mg/mL,而通過(guò)有機(jī)溶劑提取所得的抑菌物質(zhì)的最低MIC值僅為39.0mg/mL。棘托竹蓀水蒸氣蒸餾法所得揮發(fā)油對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制效果要普遍優(yōu)于革蘭氏陽(yáng)性菌。而長(zhǎng)裙竹蓀同種方法所得的產(chǎn)物對(duì)陽(yáng)性菌的抑制效果要優(yōu)于陰性菌。微量肉湯稀釋法與平板計(jì)

4、數(shù)結(jié)果所測(cè)得的MIC值對(duì)比,重合度達(dá)91.7％,證明其具有較高的準(zhǔn)確性。
　　其次,設(shè)計(jì) L16(43)正交實(shí)驗(yàn),通過(guò)超臨界 CO2萃取裝置對(duì)竹蓀中的活性物質(zhì)進(jìn)行萃取,以提取所得物質(zhì)對(duì)單增李斯特菌和副溶血性弧菌的抑菌率為衡量抑菌效果指標(biāo),設(shè)計(jì)竹蓀抑菌物質(zhì)提取的新方法。研究結(jié)果表明:超臨界 CO2萃取所得的物質(zhì)對(duì)單增李斯特菌、副溶血性弧菌均有抑制作用。棘托竹蓀在萃取壓力為20MPa,溫度為35℃,時(shí)間為120min的條件下,所得提取

5、物質(zhì)濃度在15.0mg/mL時(shí),對(duì)單增李斯特菌、副溶血性弧菌在處理后24h的抑菌率分達(dá)85.7%與98.2%。并將棘托竹蓀揮發(fā)油與超臨界 CO2提取物的抑菌活性進(jìn)行了比較,確定了超臨界 CO2提取物的抑菌活性更強(qiáng)。
　　隨后,通過(guò)電鏡觀察超微結(jié)構(gòu),以及研究相關(guān)基因表達(dá)量的變化,初步探究竹蓀提取物的抑菌機(jī)理。實(shí)驗(yàn)先提取了單增李斯特菌和副溶血性弧菌的總RNA,并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄過(guò)程得到cDNA。然后選擇相關(guān)基因,合成引物,進(jìn)行Real-ti

6、me PCR。兩種供試菌均以本菌的16S rRNA作為內(nèi)參基因,所選單增李斯特菌的特征基因?yàn)閜rfA,iap,actA;而副溶血性弧菌的特征基因?yàn)閚usA,tolC,fla,atpA,ef-Tu,fadL, dld。結(jié)果表明:從掃描電鏡(SEM)的觀察結(jié)果來(lái)看,在竹蓀提取物處理之后,單增李斯特菌和副溶血性弧菌的菌體都大大減少,單增李斯特菌的細(xì)胞出現(xiàn)變形,副溶血性弧菌的細(xì)胞膜破裂,內(nèi)容物被釋放出來(lái)。透射電鏡(TEM)的觀察結(jié)果證實(shí)了SEM

7、的結(jié)論,并展示了細(xì)胞內(nèi)容物逐步釋放的過(guò)程。而對(duì)相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量總體變化情況和不同時(shí)間點(diǎn)的變化情況的研究結(jié)果則表明:處理過(guò)后,單增李斯特菌的轉(zhuǎn)錄激活因子prfA其表達(dá)量趨勢(shì)由上調(diào)轉(zhuǎn)為下調(diào),說(shuō)明提取物能夠在轉(zhuǎn)錄階段對(duì)單增李斯特菌的生命活動(dòng)構(gòu)成影響。而副溶血性弧菌在處理過(guò)后,較對(duì)照組相比,tolC,atpA,dld表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào),fadL的表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào),證明副溶血性弧菌對(duì)竹蓀提取物并無(wú)明顯的抗性,而nusA表達(dá)量的上調(diào)和ef-Tu表達(dá)量的