14株海洋放線菌活性產(chǎn)物篩選及菌株MA03抑AFT效能研究.pdf

1、多年來，黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）對糧食、中藥材、飼料等的污染是導(dǎo)致家禽家畜體質(zhì)肉質(zhì)下降、人類罹患癌癥等健康問題的罪魁禍?zhǔn)?。通過物理、化學(xué)或生物手段有效防治黃曲霉毒素污染是環(huán)境工作者的重要研究內(nèi)容。其中，黃曲霉毒素的微生物防治法是一種既能最大限度的保持農(nóng)作物等產(chǎn)品品質(zhì)、又能減輕對環(huán)境副作用的有效手段。
　　以14株分離自黃海海域沉積物的海洋放線菌為材料，分別在淡水和海水環(huán)境下對其進行培養(yǎng)，獲得發(fā)酵上清液，通過Tipc

2、ulture方法，檢測其抑制寄生曲霉菌絲體生長和黃曲霉毒素產(chǎn)生的活性，發(fā)現(xiàn)淡水環(huán)境下培養(yǎng)的菌株MA03和MA01對寄生曲霉菌絲體生長的抑制率和黃曲霉毒素抑制率均超過80％，其乙酸乙酯粗提物抑制寄生曲霉菌絲體生長的IC50值分別為0.275 mg/mL和0.106 mg/mL。
　　此外，本研究還對上述14個菌株的其他生理活性進行了檢測。首先，利用MTT方法，檢測上述菌株發(fā)酵上清液的抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)5個菌株對腫瘤細胞增殖有抑制效果，

3、其中菌株MA03對3株受試腫瘤細胞系的抑制率均超過90%，而且，在相同濃度下，其乙酸乙酯粗提物比商品化的抗腫瘤藥物順鉑（DDP）更能高效地抑制腫瘤細胞集落的形成。其次，還發(fā)現(xiàn)了2株能產(chǎn)生性質(zhì)穩(wěn)定的色素的菌株MA01（產(chǎn)黃色素）和SHXF02-1（產(chǎn)紅色素）。
　　根據(jù)抑黃曲霉毒素的能力，其次考慮抗腫瘤的活性，選擇10株海洋放線菌，通過分析16S rDNA序列和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定菌株MA03和MA09屬于擬諾卡氏菌屬（Nocard

4、iopsis），其余8株菌都屬于鏈霉菌屬（Streptomyces）。其中，7個菌株（包括MA03）含有II型PKS基因。以菌株MA03為主要研究對象，針對其形態(tài)特征、生理生化特征以及系統(tǒng)發(fā)育特征進行深入分析，確定菌株MA03屬于白色擬諾卡氏菌蔥綠亞種（Nocardiopsis prasina）。
　　對菌株MA03進行大量發(fā)酵，獲得60 L發(fā)酵上清液，然后經(jīng)過硅膠柱層析、薄層層析、高效液相色譜及質(zhì)譜分析，對其中抑黃曲霉毒素有效成

5、分進行分離鑒定，結(jié)果顯示：海洋擬諾卡氏菌MA03的發(fā)酵液中可能存在春日霉素（Kasugamycin，抗真菌和抗細菌活性）、Phaeochromycin G（抗腫瘤活性）、1-十三醇（1-Tridecanol，抗菌活性）、手霉素（SW-B，抗真菌活性）、燼灰紅霉素（Cinerubin，抗腫瘤和抗菌活性）、紫紅菌素A（Griseorhodin A，抗菌活性）、Cylopentadecanone（4-methyl）（活性未知）、Nocaras

6、in C（抗腫瘤和抗菌活性）、Daryamide C（抗腫瘤和抗真菌活性）、Brasiliquinone B（抗菌和抗腫瘤活性）和甲基鼠李素（Rhamnazin，抗氧化活性）。該結(jié)果揭示了海洋擬諾卡氏菌MA03高效的抑黃曲霉毒素和抗腫瘤活性的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)，也表明該菌株次級代謝產(chǎn)物的生理活性具有多樣性。
　　本研究對菌株MA03發(fā)酵上清液進行了抗氧化能力檢測，結(jié)果顯示該菌株具有較強的抗氧化作用，因此MA03極有可能產(chǎn)生了Rhamna

7、zin等具有抗氧化活性的化合物。糧食儲藏實驗結(jié)果則證實菌株MA03發(fā)酵液粗提物能夠有效抑制寄生曲霉對花生和大米的侵染，強烈抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生，作用效果強于常用防霉劑雙乙酸鈉。
　　對菌株MA03所產(chǎn)纖維素酶的活性檢測結(jié)果顯示該酶能作用于甘薯渣等多種底物，且酶活力較高、穩(wěn)定性良好。因此，通過單因素實驗、Plackett-Burman實驗、最陡爬坡實驗以及響應(yīng)面實驗，確定菌株MA03在以高氏一號培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的條件下產(chǎn)抑黃曲霉毒素有效

8、成分的優(yōu)化培養(yǎng)基配方為：玉米淀粉1%、硫酸銨0.4%、MgSO4·7H2O0.05%、NaCl0.05%、K2HPO40.05%、FeSO4·7H2O0.001%以及海水含量0.6%，濃度初始pH7.0。接種量為4%。優(yōu)化培養(yǎng)條件為：發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時間為12 d。在以甘薯渣為營養(yǎng)基質(zhì)的條件下，將響應(yīng)面法優(yōu)化得到菌株MA03的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：海水含量0.64%，硫酸銨濃度0.347%，接種量8.44%，甘薯渣濃度3%，蔗糖濃度2%，

9、硫酸鎂濃度0.1%，初始pH8.5，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時間10 d。后續(xù)驗證實驗所獲得的抑制效果與預(yù)測值接近。
　　本研究從14株海洋放線菌中篩選出了擬諾卡氏菌蔥綠亞種MA03，該菌株具有強烈的抑制寄生曲霉菌絲體生長及其所產(chǎn)黃曲霉毒素積累的作用，而且能夠抑制腫瘤細胞增殖、抗氧化和產(chǎn)生纖維素酶。菌株MA03所產(chǎn)的抑黃曲霉毒素有效成分包含多種活性化合物，因此其生理活性具有多樣性。綜上所述，海洋擬諾卡氏菌MA03在黃曲霉毒素的微生物防