土壤拮抗放線菌P3-2的篩選鑒定及其發(fā)酵液中抑菌成分的分離研究.pdf

1、自第一次于微生物中提取出青霉素以來，微生物就一直成為抗生素的主要來源，而放線菌是產(chǎn)生抗生素的最大一類微生物，目前從微生物中分離的抗生素有60％以上為放線菌的次生代謝產(chǎn)物，小部分來自真菌和細(xì)菌。土壤是放線菌的主要棲息場(chǎng)所，不同地質(zhì)條件，氣候環(huán)境下的土壤進(jìn)化出了豐富多樣性的放線菌種群。而我省地處云貴高原，其地理氣候與生態(tài)環(huán)境獨(dú)特多樣化，據(jù)調(diào)查我省土壤中產(chǎn)抗生素的放線菌的研究還是空白，因此有著巨大的研究開發(fā)前景。
　　本研究通過對(duì)貴州各

2、地的土壤進(jìn)行拮抗放線菌的篩選，篩選出兩株對(duì)植物病原真菌和細(xì)菌有著高拮抗性的放線菌：P3-2與P2-35。以放線菌 P3-2為材料，從抗菌譜，發(fā)酵液穩(wěn)定性，菌株分類鑒定，主要活性次生代謝產(chǎn)物分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定進(jìn)行了系統(tǒng)研究，其主要研究結(jié)果如下：
　　1.通過土壤中放線菌的分離純化，得到256株菌株，采用抑制菌絲生長(zhǎng)速率法對(duì)256株菌株發(fā)酵液進(jìn)行生物活性初篩，篩選到10株活性較好的菌株，將這10株菌株進(jìn)行純化得到的孢子純菌株后，再對(duì)其

3、發(fā)酵液復(fù)篩，得到兩株編號(hào)為P2-35、P3-2的菌株，其發(fā)酵液對(duì)供試植物病原菌的抑制效果都非常好，P3-2菌株10倍稀釋發(fā)酵液對(duì)油菜菌核病菌，黃瓜灰霉病菌，小麥赤霉病菌，水稻紋枯病菌，半夏立枯病菌的抑制率都高達(dá)99％。兩種放線菌的抗菌譜研究表明他們的次生代謝產(chǎn)物具有廣譜抗菌性。
　　2.對(duì)放線菌 P3-2發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)其發(fā)酵液穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，發(fā)酵液中抗菌活性物質(zhì)對(duì)溫度及光照不敏感，對(duì)酸穩(wěn)定，僅在堿性條件下穩(wěn)定

4、性稍差，菌株傳代10次后遺傳學(xué)穩(wěn)定。發(fā)酵的最佳條件為，種子培養(yǎng)兩天后，將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液以10﹪(V/V)接種到小米發(fā)酵培養(yǎng)基中。28℃，170rpm培養(yǎng)3天后再以10﹪(V/V)的接種量接種到新的小米發(fā)酵培養(yǎng)基中(pH7)，其中裝液量為250ml的三角瓶中每瓶裝量100ml，28℃，170rpm搖瓶發(fā)酵3天后過濾。
　　3.利用多項(xiàng)分類法，完成了菌株 P3-2的形態(tài)特征鑒定、生理生化指標(biāo)測(cè)定和16S rDNA的序列分析。放線菌

5、菌株 P3-2的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1456bp，GeneBank登陸號(hào)為HM002750。P3-2菌株與模式菌株 Streptomyces recifensis ST100的序列同源性高達(dá)99.4％。但是在對(duì)菌株 P3-2的培養(yǎng)特征和生理生化特性的研究中發(fā)現(xiàn)，與模式菌株Streptomyces recifensis ST100相比多項(xiàng)指標(biāo)都存在著許多的不同。推測(cè)菌株 P3-2可能為鏈霉屬中Streptomyces recifen

6、sis ST100的一個(gè)近緣種。將其命名為Streptomyces sp.P3-2。
　　4.作者經(jīng)過2次硅膠柱層析，一次快速反相 C-18硅膠柱層析和制備高效液相，并在分離中都采用活性追蹤的技術(shù)，成功的在菌株 P3-2發(fā)酵液中分離出3個(gè)具有抑菌活性的純化合物。其中化合物 WJF-0197mg，WJF-0210mg，WJF-032mg。由于化合物WJF-02與WJF-03分離的量較小，沒有做結(jié)構(gòu)分析，只是用來做標(biāo)準(zhǔn)化合物，為以后課