降解絲素放線菌的分離鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化及其降解機(jī)制研究.pdf

1、桑蠶（Bombyx mori）蠶絲作為一種優(yōu)良的天然蛋白質(zhì)纖維，長(zhǎng)期以來(lái)一直被人們廣泛地應(yīng)用于紡織服裝行業(yè)。近年來(lái)，隨著高新技術(shù)的迅猛發(fā)展和各個(gè)行業(yè)之間的交叉滲透，蠶絲蛋白尤其是絲素的特殊功用日益引發(fā)人們的深切關(guān)注。絲素是生物兼容性良好的生物大分子，這使得絲素在生物材料、醫(yī)藥、食品、化工等諸多領(lǐng)域具有極高的應(yīng)用價(jià)值。絲素是一種高分子物質(zhì)，由于結(jié)構(gòu)的特異性，難于被各類蛋白酶降解成各級(jí)多肽和氨基酸而付諸實(shí)用。降解絲素的傳統(tǒng)方法主要有鹽解法、

2、酸解法、堿解法等化學(xué)方法，但鹽解法只能得到大分子的再生絲素粉，酸解法和堿解法則不可避免地會(huì)造成氨基酸的破壞，并且這些方法都需要脫鹽、脫酸等復(fù)雜的后處理，同時(shí)還存在能耗高、污染重等一系列環(huán)境問(wèn)題。因此，采用酶解法生產(chǎn)絲素肽是一種比較理想的方法。但絲素蛋白是一種典型的β-角蛋白，結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，很難被普通的蛋白酶降解。充分開(kāi)發(fā)微生物資源，利用微生物酶解決生產(chǎn)中的實(shí)際困難，是一個(gè)很好的研究思路。為此，本研究從土壤中分離到52株能夠降解絲素的放線

3、菌，從中篩選出降解能力特別強(qiáng)的Amycolatopsisdecaplanenina SA12，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)，得到了絲素降解的最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件。在此基礎(chǔ)上，利用紅外光譜、X-射線衍射、掃描電鏡觀察、熱重分析、機(jī)械性能測(cè)試、氨基酸分析等一系列手段和技術(shù)，對(duì)A.decaplaneninaSA12降解絲素的機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)的探索，主要結(jié)果如下。
　　 1.從不同地域采集土樣，并采用多種方法對(duì)其進(jìn)行預(yù)處

4、理，經(jīng)富集培養(yǎng)、梯度稀釋和劃線分離，篩選到了52株能夠在以絲素為唯一碳源和氮源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的放線菌。對(duì)其中18株活性較高的菌株，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化指標(biāo)測(cè)定、16SrDNA測(cè)序和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建等一系列手段，最終鑒定到屬。
　　 2.對(duì)分離到的高活性絲素降解放線菌A.decaplanenina SA12進(jìn)行了發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化。單因素試驗(yàn)包括最佳發(fā)酵溫度、最佳發(fā)酵初始pH值、最佳碳源及最佳碳源的最適濃度、最佳氮源及其最適濃

5、度、金屬離子影響等指標(biāo)，并在此基礎(chǔ)上，經(jīng)二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)最終得到A.decaplanenina SA12的最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件。放線菌A.decaplanenina SA12存32.5℃，pH8.0，KNO3濃度1.25％，玉米粉濃度1.25％的條件下扶得最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件。同時(shí)證明，Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+對(duì)產(chǎn)酶有較大的促進(jìn)作用，而Hg+、Cu2+、Fe3+有明顯抑制作用。
　　 3.在確定了放線菌A.deca

6、planenina SA12為胞外酶和誘導(dǎo)型酶的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)該菌株的底物作用范圍進(jìn)行了探索。結(jié)果表明，該放線菌具有較寬的底物范圍，能在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)酶，降解經(jīng)過(guò)高溫火菌處理和未經(jīng)高溫滅菌處理的絲素蛋白、羽毛角蛋白、羊毛角蛋白和人類頭發(fā)角蛋白，同時(shí)對(duì)酪蛋白也具備良好的降解作用，暗示該放線菌所產(chǎn)蛋白酶有著較為廣闊的應(yīng)用前景。但A.decaplanenina SA12對(duì)經(jīng)過(guò)高溫火菌處理的各類角蛋白，較未經(jīng)高溫滅菌處理的同種蛋白具有更

7、好的降解效果，表明酶解進(jìn)行之前的高溫滅菌過(guò)程引起的蛋白質(zhì)變性能夠大大加強(qiáng)微生物的酶解作用。
　　 4.經(jīng)掃描電鏡觀察，A.decaplanenina SA12降解絲素前期，放線菌在絲素表面首先形成一層致密的菌膜結(jié)構(gòu)，并隨著時(shí)間的推移在菌膜上形成菌落。推測(cè)該特殊結(jié)構(gòu)對(duì)不溶于水的絲素而言，破壞了造成絲素被蛋白酶解的最大障礙--絲素蛋白分子內(nèi)和分子間的大量二硫鍵聯(lián)結(jié)，使得放線菌A.decaplanenina SA12能夠較為高效地分解

8、利用絲素蛋白。另外，通過(guò)掃描電鏡觀察，放線菌發(fā)酵對(duì)于絲素蛋白的降解，較少出現(xiàn)孔隙和裂痕，更多地表現(xiàn)為各種不同斷口類型。
　　 5.A.decaplanenina SA12降解利用絲素，最靈敏的標(biāo)志指標(biāo)是機(jī)械性能、尤其是反應(yīng)絲素纖維強(qiáng)度和彈性的拉伸強(qiáng)度、拉伸模量及延伸率指標(biāo)。從絲素蛋白降解的第2d到第4d，各項(xiàng)機(jī)械指標(biāo)出現(xiàn)了崩潰性變化，拉伸強(qiáng)度從第2d的25.23±5.7 MPa迅速降低到第4d的2.11±0.51 MPa；拉伸模

9、量從第2d的175.55±28.34 GPa，迅速下降到了第4d的18.86±7.49 GPa。
　　 6.利用紅外光譜和X-射線衍射技術(shù)，結(jié)合計(jì)算機(jī)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理，對(duì)A.decaplanenina SA12降解絲素過(guò)程中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行了定量描述。結(jié)果證明，絲素發(fā)生微生物酶解過(guò)程中，穩(wěn)定態(tài)的β-折疊構(gòu)象和SilkⅡ結(jié)晶形式，其相對(duì)數(shù)量都存在逐步減少的趨勢(shì)，但同時(shí)存在波動(dòng)。這說(shuō)明，絲素酶解是一個(gè)動(dòng)態(tài)進(jìn)程，因受溶液培養(yǎng)基

10、中無(wú)機(jī)鹽離子、微生物恒溫振蕩發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中的剪切力以及降解液中極其復(fù)雜的氫鍵的斷裂與重組等諸多因素的影響，構(gòu)象之間以及不同結(jié)晶形式之間一定范圍內(nèi)的動(dòng)態(tài)變換，是一個(gè)必然的正常過(guò)程。
　　 7.菌株A.decaplanenina SA12的絲素降解液中，游離氨基酸的含量在反應(yīng)的第6d開(kāi)始陸續(xù)出現(xiàn)。最先出現(xiàn)有反應(yīng)絲素蛋白基本組成的小側(cè)鏈氨基酸殘基甘氨酸和丙氨酸，但另一主要組分絲氨酸出現(xiàn)的水平顯著低于絲素中的實(shí)際含量，猜測(cè)A.decap

11、lanenina SA12酶解絲素的酶切位點(diǎn)可能位于甘氨酸與丙氨酸之間。同時(shí)，作為絲素蛋白水解標(biāo)志的天門冬氨酸，也在第6d較早的出現(xiàn)在水解液中。
　　 8.角蛋白降解溶液中含硫化合物的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律以及外來(lái)含硫物質(zhì)對(duì)蛋白酶解進(jìn)程的影響，是一些研究者在探討角蛋白酶酶解機(jī)制時(shí)采用的一種有效手段。本研究結(jié)果表明，絲素在A.decaplanenina SA12培養(yǎng)液中，第1d硫酸鹽的含量即達(dá)到最高值。通過(guò)對(duì)于酶解液中蛋白酶酶活、可溶性蛋白

12、含量及絲素降解率的研究結(jié)果，證明在酶活檢測(cè)得到之前，溶液中絲素降解已經(jīng)出現(xiàn)，可溶性蛋白增加。這說(shuō)明關(guān)于絲素蛋白，的確存在先于蛋白酶出現(xiàn)的“非酶降解機(jī)制”，大量硫酸鹽在第1d的出現(xiàn)應(yīng)該與掃描電鏡觀察中非常明顯的包被絲素纖維的菌膜存在一定聯(lián)系。推測(cè)A.decaplanenina SA12對(duì)絲素的降解是非酶降解發(fā)生在前，蛋白酶降解發(fā)生在后，非酶降解與蛋白酶酶解協(xié)同作用的結(jié)果。非酶降解破壞了維持絲素蛋白高級(jí)形態(tài)、造成水解障礙的二硫鍵聯(lián)結(jié)，是絲素