子癇前期蛻膜組織差異蛋白的篩選與鑒定

1、<p>　　子癇前期蛻膜組織差異蛋白的篩選與鑒定</p><p>　　作者：馮亞玲，周昌菊，彭麗秀 </p><p>　　【摘要】 　　目的： 應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選子癇前期差異蛋白，探討差異蛋白與子癇前期發(fā)生的可能關(guān)系. 方法： 收集５例正常足月妊娠婦女和５例足月子癇前期重度患者胎盤(pán)母面及宮壁上的蛻膜組織，提取總蛋白. 雙向凝膠電泳技術(shù)對(duì)總蛋白進(jìn)行分離，考馬斯亮蘭染色，獲得蛋

2、白質(zhì)圖譜. 用 PDQuest軟件進(jìn)行圖像分析，尋找差異蛋白，隨機(jī)選取8個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶解，用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDITOFMS）技術(shù)獲得肽質(zhì)量指紋譜，搜尋蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定蛋白質(zhì)并進(jìn)行初步分析. 結(jié)果： 獲得了正常妊娠及子癇前期重度患者蛻膜組織雙向電泳凝膠圖譜，蛋白質(zhì)點(diǎn)子癇前期組為（436±13）個(gè)點(diǎn)，正常妊娠組為（425±16）個(gè)點(diǎn)，圖像分析結(jié)果顯示表達(dá)豐度相差2倍以上的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)

3、有14 個(gè)，它們?cè)谧影B前期中均表現(xiàn)下調(diào). 隨機(jī)選取的8個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)均成功得到鑒定，它們分別是膜聯(lián)蛋白Ⅴ,血紅蛋白β鏈,RhoGDP解離抑制劑1,氯離子細(xì)胞內(nèi)通道蛋白1,原肌球蛋白4,平滑肌蛋白22α2,α1抗胰蛋白酶和纖維蛋白原β鏈. 結(jié)論： 子癇前期重度患者蛻膜組織中存在差異蛋白，這些蛋白質(zhì)在子癇前期的發(fā)病過(guò)程可</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 先兆子癇；蛻膜；蛋白質(zhì)組學(xué)；電泳，凝膠，雙向 </p&

4、gt;<p>　　【Abstract】　AIM: To screen the differential proteins in deciduas of preeclampsia and to study their roles in preeclampsia. METHODS: The deciduas from 5 normal women of fullterm pregnancy and 5 preecl

5、ampsia patients were collected to obtain the total proteins.The proteins from the 2 groups underwent twodimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D PAGE) and Coomassie brilliant blue stained gel imaging with PD

6、Quest image analysis software. The peptide mass fingerprinting(PMF) was acqu</p><p>　　【Keywords】 preeclampsia; decidua; proteomics; electrophoresis, gel, twodimensional </p><p><b>　　0引言

7、 </b></p><p>　　子癇前期（preeclampsia,PE）是一種人類(lèi)妊娠期間特有的原因不明的多系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重危害母嬰健康［1］. 蛋白質(zhì)組學(xué)是近年來(lái)興起的一門(mén)新學(xué)科，因具有高通量的特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于臨床. 子癇前期的蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要集中在尋找早期特異性蛋白質(zhì)標(biāo)志物和發(fā)病機(jī)制的探討［2-3］，并運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)子癇前期患者的外周血、腦脊液、羊水和胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞等進(jìn)行了各種研究［4］.

8、但目前子癇前期仍然沒(méi)有理想的標(biāo)志物，具體的發(fā)病機(jī)制仍未闡明. 本實(shí)驗(yàn)利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，通過(guò)比較子癇前期重度患者和正常妊娠婦女蛻膜的蛋白表達(dá)差異，探討引起子癇前期發(fā)生的可能因素，為研究子癇前期的病因和尋找特異性標(biāo)志蛋白提供依據(jù). </p><p><b>　　1對(duì)象和方法 </b></p><p>　　1．1對(duì)象選擇 200609/200704在中南大學(xué)湘雅第三附

9、屬醫(yī)院產(chǎn)科住院的足月子癇前期重度患者５例（ 診斷及分類(lèi)參照全國(guó)統(tǒng)編教材《婦產(chǎn)科學(xué)》第 ６ 版）為子癇前期組；正常足月妊娠患者５例（無(wú)內(nèi)外科合并癥，因臀位和頭盆不稱(chēng)）為正常妊娠組. 子癇前期組與正常妊娠組年齡分別為23～34（30.56±3.26）歲和24～31（27.22±2.89）歲，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；分娩孕周分別為35+6～39+2（37.86±2.02） wk和37+2～39+6（38

10、.35±1.89） wk，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）. 兩組患者分娩方式均為硬膜外麻醉下剖宮產(chǎn). 在胎盤(pán)娩出后即刮取胎盤(pán)母面及宮壁上的蛻膜組織，用冰無(wú)菌生理鹽水沖洗，去除血液及黏液成份并吸干水份，取新鮮蛻膜組織5 g，液氮保存?zhèn)溆? 另取部分蛻膜組織用40 g/L甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋備HE染色用. 術(shù)前靜脈抽血3 mL，3000 r/min，離心15 min，取上清液保存?zhèn)溆? </p><p>

11、;　　丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，十二烷基硫酸鈉（SDS），四甲基乙二胺（TEMED），過(guò)硫酸銨（AP），丙基硫酸鹽，三羥甲基氨基甲烷等（美國(guó)SigmaAldrich 公司）；胰蛋白酶（美國(guó) Promega 公司）；低溫高速離心機(jī)（Hettich公司，16R型）；VoyayerDE STR 4307 MALDITOFMS質(zhì)譜儀（Applied Biosystem 公司）；固相pH膠條（pH 3～10，24 cm），2D Quan

12、t Kit蛋白定量試劑盒和雙向電泳系統(tǒng)（IPGphor等電聚焦儀，Ettan DALT垂直電泳槽，Imagescanner 圖像掃描儀，圖像分析軟件 PDQuest）為瑞典Amersham Biosciences公司產(chǎn)品. </p><p><b>　　1．2方法 </b></p><p>　　1.2.1蛋白樣品的制備收取的凍存蛻膜組織，經(jīng)過(guò)裂解液裂解、研磨、離心取上

13、清液提取蛻膜組織總蛋白，分裝，-70℃保存. 按2D Quant Kit蛋白定量試劑盒操作步驟測(cè)蛋白質(zhì)濃度. </p><p>　　1.2.2雙向凝膠電泳第一向固向IPG膠條等電聚焦 ，1000 μg總蛋白質(zhì)與水化上樣緩沖液混合，總體積 450 μL，加入IPG膠槽中，24 cm IPG固向膠條，線(xiàn)性，pH 3～10，IPG phor水平電泳儀電泳. 等點(diǎn)聚焦條件設(shè)置： ① 30 V，20℃水化 14 h； ②

14、 500 V/h； ③ 快速升壓 1000 V/h， 除鹽； ④ 線(xiàn)性升壓 8000 V/8.5 h等電聚焦. 膠條在平衡液A液與B液各平衡15 min后膠條移至分離膠上進(jìn)行第二向電泳即SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳. 電泳條件如下：恒壓，2.5 w/膠，30 min，然后以11 w/膠恒功率電泳， 直至溴酚藍(lán)前沿遷移至凝膠底邊停止電泳. 第二向電泳時(shí)間約需6 h左右. </p><p>　　1.2.3考馬斯亮

15、藍(lán)染色取出電泳后的凝膠，雙蒸水清洗后用考馬斯亮藍(lán)G250的染色方法進(jìn)行顯色. 染色固定過(guò)夜，雙蒸水清洗脫色直至背景清晰. </p><p>　　1.2.4圖像采集與分析考馬斯亮藍(lán)染色后的凝膠通過(guò)ImageScanner掃描儀以及LabScan掃描儀控制軟件進(jìn)行圖像掃描以獲取二維凝膠的電子圖像. 運(yùn)用圖像分析軟件PDQuest 7.0進(jìn)行分析， 包括蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測(cè)，背景消減，標(biāo)準(zhǔn)化，匹配，建立平均凝膠，比較差異等

16、分析以確立差異表達(dá)的蛋白質(zhì). </p><p>　　1.2.5蛋白質(zhì)酶解經(jīng)過(guò)圖像分析，隨機(jī)選取豐度差異表達(dá)相差2倍以上的14個(gè)點(diǎn)中的8個(gè)點(diǎn)做質(zhì)譜鑒定. 用人工方法切膠，洗膠，脫色，脫水，原位酶解. 然后進(jìn)行樣品萃取，點(diǎn)樣. </p><p>　　1.2.6MALDITOFMS質(zhì)譜分析將制備好的點(diǎn)樣板放入VoyagerDE STR 4307 MALDITOFMS質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析，

17、獲得肽質(zhì)量指紋譜（peptide mass fingerprinting, PMF）. </p><p>　　1.2.7數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)MALDITOFMS質(zhì)譜圖解譜采Mascot Wizard軟件進(jìn)行 ，Mascot Wizard軟件均采用其默認(rèn)參數(shù)設(shè)置. 其查詢(xún)網(wǎng)址為：www.matrixscience.com/cgi/searchform.pl?FORMVER=2＆SEARCH=PMF. 在NCBInr,S

18、wissprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索理論上酶解肽段能與之相匹配的蛋白,結(jié)合蛋白質(zhì)在膠上的等電點(diǎn)和分子量鑒定蛋白質(zhì). Mascot分?jǐn)?shù)＞55分則認(rèn)為得到鑒定，否則視為未得到鑒定. </p><p>　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，以α=0.05（雙尾）為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P&lt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. </p><p

19、><b>　　2結(jié)果 </b></p><p>　　2．1蛻膜組織的HE染色經(jīng)HE染色證實(shí)，實(shí)驗(yàn)所取子癇前期組與正常妊娠組胎盤(pán)母面組織均為蛻膜組織. 大部分典型多邊形蛻膜細(xì)胞，呈鋪磚狀排列，未見(jiàn)絨毛（圖1）. </p><p>　　圖1蛻膜組織HE ×400 </p><p>　　2．2蛻膜組織總蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜 兩組蛻膜組

20、織總蛋白在相同條件下進(jìn)行雙向凝膠電泳分離，并重復(fù)3次. 圖像掃描后，得到重復(fù)性好的兩組蛻膜組織的雙向電泳圖譜 （ 圖 2）. 子癇前期組圖譜檢測(cè)到（ 436±13）個(gè)點(diǎn)， 平均匹配率為79.2%. 正常妊娠組圖譜檢測(cè)到（425±16）個(gè)點(diǎn)，平均匹配率為78.6%. 蛋白點(diǎn)主要集中在Mr = 13～80 ku，pH=3～8范圍. </p><p>　　A：正常妊娠組蛻膜組織； B：子癇前期組

21、蛻膜組織. </p><p>　　圖2蛻膜組織考馬斯亮藍(lán)染色圖譜 </p><p>　　2.3差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定PDQuest 軟件進(jìn)行圖像分析發(fā)現(xiàn)，選取豐度差異表達(dá)相差2倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)有14個(gè)，在子癇前期組表達(dá)均下調(diào). 隨機(jī)選擇8個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)均成功得到鑒定. 圖3為子癇前期組和正常妊娠組部分顯著差異蛋白點(diǎn)的局部放大圖. 黑箭頭所指為已鑒定的部分顯著差異蛋白質(zhì)點(diǎn),其數(shù)字代表

22、相應(yīng)的蛋白質(zhì)點(diǎn)號(hào). 用Mascot軟件搜索蛋白數(shù)據(jù)庫(kù),獲得對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)(表1). </p><p>　　A：正常妊娠組蛻膜組織；B：子癇前期組蛻膜組織. </p><p>　　圖3蛻膜組織部分顯著差異蛋白點(diǎn)的局部放大圖 </p><p><b>　　3討論 </b></p><p>　　人體蛻膜組織是母胎界面的重要組成部

23、分，與胎兒滋養(yǎng)層直接接觸，具有參與母胎免疫耐受形成及維持妊娠的功能. 在呂英璞等［5］的研究中發(fā)現(xiàn)子癇前表1蛋白質(zhì)點(diǎn)肽質(zhì)量指紋圖譜檢索SWISSPROT數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果期患者蛻膜組織中Th1/Th2比率明顯高于外周血，母胎界面的局部免疫失調(diào)，尤其是Th1細(xì)胞的過(guò)度表達(dá)是子癇前期發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一. 本研究選取分娩后的蛻膜組織，能夠直接反應(yīng)該疾病母胎界面存在的蛋白分子變化. </p><p>　　在本研究中，膜聯(lián)蛋白Ⅴ

24、在子癇前期組中表達(dá)明顯下調(diào). 膜聯(lián)蛋白Ⅴ是一種胎盤(pán)內(nèi)抗凝蛋白，對(duì)暴露于活化血小板表面的磷脂酰絲氨酸具有高親和性. 在體內(nèi),磷脂酰絲氨酸存在于活化血小板或活化內(nèi)皮細(xì)胞的質(zhì)膜外層,為凝血因子提供一個(gè)聚集進(jìn)而促發(fā)凝集的表面. Tait 等［6］在兔和豬血栓模型中都發(fā)現(xiàn)了膜聯(lián)蛋白Ⅴ的抗凝作用具有血小板指引靶向性. 膜聯(lián)蛋白Ⅴ這種抗凝蛋白不足很可能是造成子癇前期患者的高凝狀態(tài)的原因之一. α1抗胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，可通過(guò)對(duì)各種蛋白

25、酶的抑制作用,保護(hù)組織免受蛋白酶破壞,從而維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定. 凝血酶也是一種以絲氨酸為活動(dòng)中心的蛋白酶. 本研究中發(fā)現(xiàn)α1抗胰蛋白酶在子癇前期組中表達(dá)下調(diào). 由此我們推測(cè)由于α1抗胰蛋白酶這種凝血酶抑制劑分泌不足導(dǎo)致凝血酶增高從而參與了子癇前期患者高凝狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展. RhoA屬于Rho家族蛋白的Rho亞家族成員,是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子. 它能結(jié)合并水解鳥(niǎo)苷酸,結(jié)合GTP為活性型，結(jié)合GDP為失活型. 有研究［7］表明RhoA可能

26、通過(guò)調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)、低氧反應(yīng)及血管舒縮功能等參了與子癇前期的發(fā)病. 本研究發(fā)現(xiàn)RhoGDP解離</p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】 </b></p><p>　?。?］Koy C, Heitner JC, Woisch R, et al. Cryodetector mass spectrometry profiling of plasma samples f

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