兩種硅酸鹽細(xì)菌特異性PCR方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、膠質(zhì)類芽孢桿菌和土壤類芽孢桿菌是兩種典型的硅酸鹽細(xì)菌,它們作為生物肥料已長期用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上,近年在生物冶金和廢水處理中也顯示了很好的應(yīng)用前景。目前許多研究致力于篩選膠質(zhì)類芽孢桿菌和土壤類芽孢桿菌菌株以滿足各種應(yīng)用,因此建立這兩種硅酸鹽細(xì)菌的快速鑒定方法對相關(guān)研究具有重要意義。
　　 本論文建立了膠質(zhì)類芽孢桿菌和土壤類芽孢桿菌的特異性PCR檢測方法,可以成功地用于膠質(zhì)類芽孢桿菌和土壤類芽孢桿菌的快速鑒定,為膠質(zhì)類芽孢桿菌和土壤類芽

2、孢桿菌的應(yīng)用和開發(fā)提供了便捷方法。
　　 首先,以gyrB基因?yàn)榘袠?biāo),設(shè)計(jì)了4對膠質(zhì)類芽孢桿菌的特異性引物F1-R5、F1-R8、F2-R5和F2-R8。對4對引物進(jìn)行了BLASTN搜索、二級結(jié)構(gòu)分析及初步的PCR檢測,確定一對引物:F2(5'-ACG GATATC TCC CAG ACG TTCAT-3')和R5(5'-ACG GGC ACGCTG CGC CTG TAC G-3')具有較好的特異性,能有效區(qū)分膠質(zhì)類芽孢桿菌和

3、與之親緣關(guān)系最近的土壤類芽孢桿菌,這對引物可特異性地從膠質(zhì)類芽孢桿菌中擴(kuò)增出519 bp的單一產(chǎn)物。使用引物對F2和R5,建立了膠質(zhì)類芽孢桿菌的菌體PCR方法,該方法具有較好的特異性和靈敏度,其檢測限在1到10細(xì)胞之間。
　　 其次,按照同樣的方法,設(shè)計(jì)了5對土壤類芽孢桿菌的特異性引物F11-R13、F11-R31、F22-R2、F22-R4和F22-R43。經(jīng)過BLASTN搜索、二級結(jié)構(gòu)分析及初步的PCR檢測,確定4對引物(F

4、11-R13、F11-R31、F22-R2和F22-R4)具有較好的特異性,它們能有效區(qū)分土壤類芽孢桿菌和膠質(zhì)類芽孢桿菌。這4對引物可分別從土壤類芽孢桿菌中擴(kuò)增出一條223 bp、124 bp、235 bp和232 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。分別建立了4對引物的菌體PCR方法,該方法具有較好的特異性和靈敏度,其檢測限在1到10細(xì)胞之間。
　　 最后,將以上特異性PCR方法用于檢測土壤中的總基因組和硅酸鹽細(xì)菌分離物。結(jié)果,膠質(zhì)類芽孢桿菌特異

5、性PCR方法能成功擴(kuò)增一個(gè)農(nóng)業(yè)土壤樣品的總基因組DNA,獲得預(yù)期產(chǎn)物;該產(chǎn)物的20個(gè)克隆子序列與膠質(zhì)類芽孢桿菌的gyrB基因序列高度相似。隨即,用菌體PCR方法對25個(gè)土壤樣品分離物進(jìn)行了檢測,其中19個(gè)分離物產(chǎn)生陽性擴(kuò)增,對gyrB基因的測序和序列分析表明這19個(gè)分離物屬于膠質(zhì)類芽孢桿菌,其它6個(gè)陰性擴(kuò)增的分離物屬于類芽孢桿菌屬的其它種。對于土壤類芽孢桿菌特異性PCR檢測,只有引物F22-R2和F22-R4從土壤總基因組中產(chǎn)生陽性擴(kuò)增

6、,但經(jīng)克隆、測序和序列分析發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物序列與土壤類芽孢桿菌gyrB基因的同源性僅為78.6-83.2％,引物F11-R13及F11-R31未產(chǎn)生陽性擴(kuò)增;4對引物也不能從25個(gè)分離物中產(chǎn)生陽性擴(kuò)增,表明這些分離物中沒有土壤類芽孢桿菌?？梢?膠質(zhì)類芽孢桿菌特異性PCR可有效用于膠質(zhì)類芽孢桿菌的應(yīng)用研究,基于引物F11-R13或F11-R31的土壤類芽孢桿菌特異性PCR也有同樣的應(yīng)用潛力,但有待進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　 綜上所述,本論文成