APC基因甲基化特異性PCR檢測(cè)方法的建立及其在肺癌診斷中的應(yīng)用.pdf

1、背景：DNA甲基化對(duì)轉(zhuǎn)錄的抑制作用是表觀遺傳學(xué)中一項(xiàng)非常重要的內(nèi)容。人類基因組中約有29000個(gè)CpG島，超過60﹪的基因啟動(dòng)子和第一外顯子都包含CpG島。DNA甲基化與腫瘤的關(guān)系正日益引起人們的關(guān)注，檢測(cè)DNA的異常甲基化有助于深入理解腫瘤形成機(jī)制，并且可為腫瘤的早期診斷、病理分型、療效評(píng)估及復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等提供十分重要的信息。 2004年我國衛(wèi)生部提供的資料顯示肺癌的發(fā)病率與死亡率已居惡性腫瘤之首。APC基因，即腺瘤性結(jié)腸息肉病相

2、關(guān)基因(ademomatouspolyposiscoli，APC)，其蛋白質(zhì)的表達(dá)在肺癌中降低，卻很少發(fā)現(xiàn)突變。 目的：建立含有弱陽性質(zhì)控品的甲基化特異性PCR(methylationspecificPCR，MSP)檢測(cè)技術(shù)。研究APC基因甲基化對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響及其與肺癌的關(guān)系。 方法：酚-氯仿法提取臍帶血淋巴細(xì)胞DNA，轉(zhuǎn)甲基制備陽性模板，化學(xué)修飾，MSP后獲得目的片段，克隆到pMD18-T質(zhì)粒載體，測(cè)序篩選陽性和陰性質(zhì)粒

3、，紫外分光光度法對(duì)陽性質(zhì)粒定量，優(yōu)化MSP的各項(xiàng)參數(shù)，制備弱陽性質(zhì)控品。用建立的MSP技術(shù)分析103份DNA標(biāo)本的甲基化狀態(tài)，這其中包括：39例肺癌病例(78份DNA)；2例肺部其他腫瘤病例(4份DNA)；18例正常人標(biāo)本(14份肺組織DNA，4例門診血的淋巴細(xì)胞DNA)；3株肺癌細(xì)胞。Trizol法提取組織和細(xì)胞RNA，以β-actin為內(nèi)參照，SYBRGreenⅠ熒光定量RT-PCR檢測(cè)肺癌患者的腫瘤組織相對(duì)其正常組織的APC表達(dá)量

4、。分析研究APC甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)、年齡、臨床分期、病理分級(jí)、吸煙史、預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果： 測(cè)序結(jié)果顯示陽性質(zhì)粒所有CpG中的C保持不變，其余的C均變?yōu)門。MSP反應(yīng)體系的最佳Mg2+濃度為2.0mM，最佳引物濃度為200nM。MSP的敏感性為105拷貝/ml，其濃度對(duì)應(yīng)的陽性質(zhì)粒為弱陽性質(zhì)控品。 利用已建立的MSP方法，共檢測(cè)了103份DNA標(biāo)本的甲基化狀態(tài)，其中肺癌患

5、者的肺正常組織陽性率為30.8﹪(12/39)，腫瘤組織陽性率為66.7﹪(26/39)。1例硬化性血管瘤的肺組織、1例惡性淋巴瘤病例的肺組織和14例正常人肺組織均無甲基化，另外4例門診血的淋巴細(xì)胞均無甲基化，3株肺癌細(xì)胞中NCI-H460陽性，而SPC-A1和NCI-H446陰性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：肺癌患者腫瘤組織的APC基因甲基化率高于相應(yīng)正常組織，P=0.001。肺癌患者正常肺組織較正常人肺組織APC基因的甲基化率高，P=0.023

6、。肺癌患者腫瘤肺組織較正常人肺組織APC基因的甲基化率高，P=0.000。肺癌患者腫瘤組織相對(duì)其正常肺組織的APC基因表達(dá)量為0.281，88.0﹪的肺腫瘤組織甲基化陽性標(biāo)本的APC基因表達(dá)降低，P=0.005。APC基因甲基化與年齡和預(yù)后之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：本研究建立了抑癌基因APC基因啟動(dòng)子1A序列的MSP檢測(cè)技術(shù)。構(gòu)建了攜帶甲基化陽性的APC基因啟動(dòng)子的質(zhì)粒并制備了弱陽性質(zhì)控品，對(duì)MSP檢測(cè)靈敏度進(jìn)行質(zhì)量控制，降低了

7、檢測(cè)的假陰性率。肺癌細(xì)胞株H460的APC基因甲基化陽性，這在國內(nèi)外尚未見報(bào)道。 APC基因甲基化導(dǎo)致其表達(dá)降低，而表達(dá)的降低則導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路和細(xì)胞骨架等的紊亂，這引發(fā)了細(xì)胞的癌變，導(dǎo)致肺癌發(fā)生，并伴隨著肺癌的進(jìn)展，導(dǎo)致預(yù)后不良。APC基因甲基化隨著年齡的增加有增高的趨勢(shì)；APC基因在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用；APC基因發(fā)生甲基化的病人預(yù)后不良。這些都提示APC基因的甲基化可能是肺癌早期診斷和預(yù)后的新分子標(biāo)志物，其具