比較兩種干眼模型小鼠淚腺及其全身非特異性免疫反應(yīng)的研究.pdf

1、目的：
　　淚液生成不足型干眼模型和蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼模型分別模擬淚液生成不足型干眼及蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼，是主要的兩種干眼模型。目前東莨菪堿誘導(dǎo)的淚液生成不足型干眼模型已經(jīng)被證實(shí)角結(jié)膜出現(xiàn)廣泛的炎癥，并且淚腺被廣泛的炎癥因子浸潤(rùn)，但目前在蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼小鼠模型中淚腺的炎癥情況及結(jié)構(gòu)改變還不明確。本課題旨在研究這兩種干眼模型小鼠的淚腺結(jié)構(gòu)改變，以及免疫細(xì)胞在淚腺和頸部淋巴結(jié)中的分布情況。
　　方法：
　　(1)取132只4-6周

2、齡的雌性C57BL/6小鼠，60只小鼠飼養(yǎng)于智能環(huán)境控制系統(tǒng)(ICES)中作為實(shí)驗(yàn)組(E)，在放入ICES后1周，2周，4周，6周后分別取出小鼠淚腺及頸部淋巴結(jié)，分別標(biāo)記為E1，E2，E4，E6組。12只C57BL/6小鼠飼養(yǎng)于正常環(huán)境中，同時(shí)連續(xù)5天皮下注射東莨菪堿(0.5mg/0.2ml)，一天四次，作為東莨菪堿組(SCOP)。60只C57BL/6小鼠飼養(yǎng)于正常環(huán)境中，不予任何處理作為正常對(duì)照組(N)。
　　(2)使用伊紅-蘇

3、木素染色檢測(cè)放入ICES誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)即E1，E2，E4，E6組，SCOP組及正常對(duì)照組的小鼠淚腺的大體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。
　　(3)使用透射電子顯微鏡觀察E1，E2，E4，E6組，SCOP組及正常對(duì)照組小鼠淚腺組織的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。
　　(4)使用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)E1，E2，E4，E6組，SCOP組及正常對(duì)照組小鼠淚腺組織的T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記物CD4，CD8，CD11b，CD103，CD45，用以觀察各組小鼠淚腺組織中

4、免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。
　　(5)最后使用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)分析E1，E2，E4，E6組，SCOP組及正常對(duì)照組小鼠頸部引流淋巴結(jié)內(nèi)的CD4，CD8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞的比例，檢測(cè)是否存在由東莨菪堿阻滯膽堿能神經(jīng)通路以及ICES誘導(dǎo)的干燥環(huán)境應(yīng)激引起的小鼠全身非特異性免疫反應(yīng)。
　　結(jié)果：
　　(1)HE染色后普通光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)ICES組相比正常小鼠，淚腺腺泡體積增大，而SCOP組腺泡體積變小萎縮，淚腺結(jié)構(gòu)破壞，間質(zhì)被淋巴細(xì)胞及

5、纖維組織替代。我們假設(shè)正常組的腺泡面積為1，檢測(cè)SCOP組，ICES誘導(dǎo)組E1，E2，E4，E6組中各組腺泡面積平均值與正常組腺泡面積大小的比值分別為0.6，1.03，1.19，1.12，1.05。可見(jiàn)SCOP組的淚腺腺泡面積顯著小于正常組(P=0.01)和ICES誘導(dǎo)組(P＜0.05)。并且，我們還發(fā)現(xiàn)ICES組中單個(gè)淚腺腺泡的面積比正常對(duì)照組稍大(P＜0.001)。
　　(2)透射電鏡下可見(jiàn)ICES組小鼠淚腺腺泡胞質(zhì)內(nèi)有多量的

6、分泌顆粒聚集，證實(shí)光學(xué)顯微鏡下所見(jiàn)的ICES組腺泡體積增大的原因很可能是這些分泌顆粒的聚集，相反，SCOP組腺泡胞質(zhì)內(nèi)分泌顆粒數(shù)量比正常對(duì)照組少，分泌顆粒的體積比正常對(duì)照組小。正常組，SCOP組，E1，E2，E4，E6組中單個(gè)腺泡內(nèi)分泌小泡的面積總和所占的比例分別為0.0015±0.0007,0.0009±0.0005,0.0015±0.0006,0.0019±0.0009,0.0015±0.0007,0.0015±0.0012?？梢?jiàn)I

7、CES誘導(dǎo)組和正常對(duì)照組中的小鼠淚腺單個(gè)腺泡胞質(zhì)中分泌小泡面積總和顯著大于SCOP組(P＜0.001)。另外我們還發(fā)現(xiàn)，在E2組這一比例顯著高于正常組(P＜0.001)。正常組，SCOP組，ICES誘導(dǎo)組E1，E2，E4，E6組中淚腺腺泡中的分泌小泡的直徑分別為0.65±0.19，0.41±0.11，0.76±0.17，0.75±0.15，0.75±0.17，0.65±0.16?？梢?jiàn)ICES誘導(dǎo)組和正常對(duì)照組中的分泌小泡的直徑顯著大于S

8、COP組(P＜0.001)。另外，ICES誘導(dǎo)組中的E1，E2，E4組的分泌小泡的直徑顯著大于正常對(duì)照組(P＜0.001)。
　　(3)免疫組織化學(xué)染色顯示淚腺中CD4陽(yáng)性淋巴細(xì)胞數(shù)量在正常對(duì)照組和ICES誘導(dǎo)組顯著低于SCOP組(P＜0.001)，ICES組淚腺組織中CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞數(shù)量在各時(shí)間段與正常組相比沒(méi)有太大變化。CD8陽(yáng)性淋巴細(xì)胞數(shù)量在E1，E2和E3組較正常組低，而E1和E6組較SCOP組低(P＜0.05)。CD

9、103陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在ICES組較正常組高，但比SCOP組低(P＜0.05)。CD11b陽(yáng)性淋巴細(xì)胞數(shù)量在ICES組較SCOP組低(P＜0.05)，除E2組比正常組高外，其余時(shí)間點(diǎn)的數(shù)量與正常組相似。CD45陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在ICES組較SCOP組低(P＜0.05)，除E2和E4組比正常組高外，其余時(shí)間點(diǎn)與正常組相似。
　　(4)流式細(xì)胞術(shù)分析各組小鼠頸部引流淋巴結(jié)內(nèi)的CD4，CD8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞占所有淋巴細(xì)胞的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ICES組

10、2周時(shí)CD4陽(yáng)性T細(xì)胞的比例最高，隨后4周這一比例逐漸減少;ICES組2周時(shí)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的比例最低，隨后4周這一比例逐漸增加。SCOP組CD4陽(yáng)性T細(xì)胞的比例與ICES組相比無(wú)明顯差異，CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的比例則較ICES組的低。各組CD4與CD8的比例均在正常范圍內(nèi)，因此干燥環(huán)境刺激并未引起小鼠的全身非特異性免疫反應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　(1)ICES組小鼠的淚腺結(jié)構(gòu)完整，腺泡體積增大，腺泡內(nèi)分泌顆粒聚集，SCOP組小鼠的