位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在甘藍(lán)型油菜中的建立.pdf

1、位點(diǎn)特異性重組技術(shù)是通過(guò)特異性重組酶對(duì)DNA特定序列進(jìn)行準(zhǔn)確切割和重新連接,從而在基因或染色體水平上對(duì)生物進(jìn)行遺傳改造的一種技術(shù)。位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因植物基因的定點(diǎn)整合、基因刪除、多基因植物表達(dá)載體建立、多基因疊加、遺傳育種等方面都有十分重要的意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)選用Cre／loxP和FLP／FRT兩個(gè)位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng),以GFP(綠色熒光蛋白)為報(bào)告基因成功構(gòu)建了兩個(gè)表達(dá)載體Z1與Cer40,用于在甘藍(lán)型油菜中建立Cre

2、／loxP及FLP／FRT兩個(gè)位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)。在轉(zhuǎn)基因成苗實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,采用農(nóng)桿菌浸染法轉(zhuǎn)化植株,摸索了卡納霉素抗性篩選的最佳濃度,以下胚軸和子葉柄為外植體的再生體系經(jīng)過(guò)共培培養(yǎng)、延遲培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)及生根培養(yǎng)等植物組織培養(yǎng)過(guò)程成功轉(zhuǎn)化了12棵Z1載體陽(yáng)性苗和3棵Cer40載體陽(yáng)性苗。
　　 本實(shí)驗(yàn)還就實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由于一些染菌和移栽失敗,造成一些陽(yáng)性苗瀕臨滅絕的問(wèn)題摸索了一整套以葉片為外植體再生成苗的體系。并應(yīng)用在了稀缺苗上,成功

3、得到了大量再生苗,解決了此項(xiàng)問(wèn)題。
　　 后期成苗檢測(cè)研究過(guò)程中,用普通PCR方法在油菜基因組中檢測(cè)到卡納抗性基因,初步判斷為轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)以CRE酶基原因探針進(jìn)行PCR-southern bolt雜交分析,分析結(jié)果顯示有明顯的預(yù)期信號(hào)出現(xiàn),進(jìn)一步表明表達(dá)載體已經(jīng)整合到油菜染色體中。通過(guò)半定量法在RNA水平上檢測(cè)到了Cre基因的表達(dá),并得出了每個(gè)植株表達(dá)量的差異。這不僅證實(shí)了位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)成功的在甘藍(lán)型油菜中表達(dá),同時(shí)也為