HBV基因分型檢測(cè)芯片的制備及臨床應(yīng)用.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)的感染呈世界性分布，在我國(guó)尤其多見。HBV感染可導(dǎo)致急、慢性肝炎(CHB)，甚至肝硬化，肝癌。由于病毒變異，HBV基因組分為多個(gè)型。根據(jù)其核苷酸序列差異，HBV可劃分為(A-H)8種基因型。目前研究認(rèn)為，HBV基因型是影響HBV感染者預(yù)后的重要因素之一，因此建立一套快速、準(zhǔn)確的HBV分型檢測(cè)技術(shù)十分必要。目前診斷HBV基因型的常用方法有DNA測(cè)序，聚合酶聯(lián)反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法(PCR-RFLP)等，在結(jié)

2、果準(zhǔn)確性、技術(shù)簡(jiǎn)單性方面各有優(yōu)劣，且不能同時(shí)檢測(cè)所有基因型。近幾年發(fā)展起來(lái)的基因芯片技術(shù)彌補(bǔ)上述方法的缺陷。本課題的研究目的在于：建立DNA芯片檢測(cè)HBV基因分型的研究方法；并對(duì)芯片檢測(cè)的特異性、準(zhǔn)確性、靈敏度和重復(fù)性進(jìn)行測(cè)試、分析；通過(guò)調(diào)查杭州地區(qū)HBV的基因型分布對(duì)HBV基因分型檢測(cè)芯片在臨床上的應(yīng)用進(jìn)行初步探索，為病原體基因型檢測(cè)芯片這種高科技方法在臨床上的應(yīng)用進(jìn)行積極探索，積累有益經(jīng)驗(yàn)。 方法: 1.有關(guān)探針、引

3、物設(shè)計(jì)在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查找HBV各型Pre-S基因組序列，并利用DNAStar軟件進(jìn)行MegAlign分析，找出其保守序列和特征序列。根據(jù)生物學(xué)軟件Primer primer5.0設(shè)計(jì)出不同分型探針及其PCR引物。并對(duì)探針進(jìn)行分析。 2.基因芯片的設(shè)計(jì)、制作將設(shè)計(jì)好的多條寡核苷酸探針在醛基基片的特定位置上，用點(diǎn)樣儀將探針固定，同一探針平行重復(fù)點(diǎn)樣3次，以觀察其重復(fù)性，為了能在每次實(shí)驗(yàn)時(shí)判定實(shí)驗(yàn)操作的正確性，以及是否存在污

4、染，在芯片設(shè)計(jì)時(shí)增加了如下的質(zhì)控點(diǎn)；標(biāo)志列、陽(yáng)性對(duì)照行、陰性對(duì)照行。 3.雜交、顯色技術(shù)提取血清中DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后滴于基因芯片上進(jìn)行雜交，采用酶促顯色技術(shù)檢測(cè)雜交結(jié)果。 4.檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性隨機(jī)抽取PCR陽(yáng)性標(biāo)本送交上海生工公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與芯片雜交結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，觀察芯片雜交反應(yīng)的準(zhǔn)確性。 5.檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性分析取20份HBV-DNA陽(yáng)性標(biāo)本，每份標(biāo)本用本法重復(fù)測(cè)定3次，觀察結(jié)果是否一致。

5、 結(jié)果: 1.探針、引物設(shè)計(jì)在Genbank中查到17個(gè)HBV Pre-S基因組序列，共為A、B、C、D、E、F、G7個(gè)基因型，對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)化樹分析和多序列比對(duì)。根據(jù)序列差異情況和保守序列分布情況設(shè)計(jì)出可以擴(kuò)增出特異序列的PCR引物和7個(gè)探針，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為340bp左右。到NCBI上將設(shè)計(jì)好的探針進(jìn)行BLAST，分析評(píng)分在前50個(gè)的序列及其完全匹配序列，與探針完全匹配的序列基因型一致的為97％。 2.臨床標(biāo)本檢測(cè)用制

6、備的基因芯片檢測(cè)HBV各基因型(A-G)標(biāo)準(zhǔn)病毒株DNA樣本，檢測(cè)結(jié)果與已知基因型(經(jīng)核酸測(cè)序)完全一致；106例HBV-DNA陽(yáng)性標(biāo)本均測(cè)出其基因型，其中B型37例，占34.91％，C型69例，占65.09％。未發(fā)現(xiàn)其他基因型與混合型感染。 3.DNA序列分析測(cè)序結(jié)果與芯片雜交結(jié)果完全一致，進(jìn)一步證實(shí)了檢測(cè)結(jié)果的特異性、準(zhǔn)確性。經(jīng)過(guò)測(cè)序分析，雜交特異性和探針匹配程度一致。 4.檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性測(cè)定和靈敏度分析取20份HB

7、V-DNA陽(yáng)性標(biāo)本，每份標(biāo)本用本法重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果一致，顯示出良好的重復(fù)性。106例陽(yáng)性血清，采用熒光定量PCR檢測(cè)，HBV-DNA水平最低者為2*104copies/ml，初步認(rèn)定該芯片的檢測(cè)靈敏度不低于此水平。 結(jié)論: 1.通過(guò)對(duì)HBV基因組的生物信息學(xué)分析，可以設(shè)計(jì)出相應(yīng)的探針和引物用于HBV基因分型芯片制作。 2.設(shè)計(jì)制備的HBV基因分型芯片能檢測(cè)出HBV基因型，初步應(yīng)用于臨床后，顯示出滿意的準(zhǔn)確性、特