p16基因甲基化檢測型芯片的制備與應(yīng)用.pdf

1、在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,基因功能的改變包括基因機(jī)制(genetic mechanism)和后生機(jī)制(epigenetic mechanism).DNA甲基化是目前已知哺乳動物細(xì)胞的唯一后生改變.抑癌基因的表達(dá)是受其操縱子所調(diào)控的,DNA序列中5'位胞嘧啶(C)的甲基化狀態(tài)在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中起著重要作用,其中啟動子區(qū)CpG島甲基化是導(dǎo)致抑癌基因失活的重要原因.DNA甲基化已成為研究熱點(diǎn),有關(guān)研究方法發(fā)展迅速.主要的甲基化檢測方法有:DNA印跡

2、,限制性內(nèi)切酶-PCR,測序法,甲基化特異的PCR(MSP),甲基化敏感性單鏈核苷酸引物延伸(Methylation-sensitive single nucleotide primer extension,MS-SnuPE),變性高效液相色譜法(DHPLC)和微陣列技術(shù)(DNA Microarray).該課題的研究對象為胃癌p16基因啟動子區(qū)和一部分外顯子1的CpG島.p16抑癌基因的功能與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)密切相關(guān),它是細(xì)胞周期的一種負(fù)性

3、調(diào)控因子,阻止細(xì)胞生長分裂.p16基因甲基化在某些腫瘤中表現(xiàn)出早期事件的特性,使p16基因甲基化的檢測具有早期診斷價值.我們將半巢式MSP的方法用于60例胃癌p16基因甲基化的初步檢測.半巢式MSP是一種改進(jìn)的MSP.結(jié)果表明用半巢式MSP檢測的甲基化發(fā)生率為61.7％(37/60),比單獨(dú)采用MSP提高了18.4％,并提示胃癌病例的p16基因啟動子區(qū)存在甲基化發(fā)生的不同模式.為了定量研究腫瘤中甲基化的發(fā)生情況,我們繪制了不同位點(diǎn)的熒光

4、強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,制備了p16基因甲基化檢測型基因芯片.每相鄰2或3個CpG位點(diǎn)設(shè)計一組探針,每組探針包括分別與完全甲基化DNA和完全非甲基化DNA互補(bǔ)的兩條探針.將甲基化純陽性DNA和完全不發(fā)生甲基化的陰性DNA按不同比例混合,與固定好9組探針的基因芯片雜交,得到不同位點(diǎn)的熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖.我們得到了對應(yīng)于9組探針(23個CpG位點(diǎn))的9條熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線,均呈很好的線性關(guān)系.實現(xiàn)了對臨床胃癌樣本的芯片定量分析,結(jié)果與半巢式MSP的檢