急性白血病P16基因甲基化狀態(tài)檢測(cè)及EGCG逆轉(zhuǎn)U937細(xì)胞P16基因甲基化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：應(yīng)用巢式甲基特異性PCR法(nested methylation specific PCR，rNSP)和DNA克隆測(cè)序檢測(cè)成人急性白血病P16基因的甲基化狀態(tài)，探討P16基因甲基化與白血病發(fā)生、發(fā)展可能的關(guān)系，從而進(jìn)一步闡明白血病發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制；探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)逆轉(zhuǎn)人急性白血病U937細(xì)胞株P(guān)16基因甲基化狀態(tài)及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄作用、誘導(dǎo)蛋白重新表達(dá)及其可能的機(jī)制。 方法：采用INSP和DNA克隆測(cè)序

2、檢測(cè)成人急性白血病P16基因的甲基化狀態(tài)；采用SRB法檢測(cè)EGCG對(duì)人白血病細(xì)胞系U937細(xì)胞增殖、活力的影響；nMSP法檢測(cè)藥物作用前后P16甲基化狀態(tài)變化，RT-PCR法檢測(cè)P16、甲基轉(zhuǎn)移酶DNMTl、DNMT3A、DNMT3B基因mRNA的表達(dá)，Westren Blot蛋白免疫印跡法檢測(cè)P16蛋白的表達(dá)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀DNA倍體分析法探討EGCG對(duì)U937細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果：1.82例急性白血病(AL)患者P16基因

3、甲基化的出現(xiàn)率為39.0％，其中急性髓系白血病(AML)患者為41.4％，24例急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者為33.3％，初治AL患者為36.6％而復(fù)發(fā)則為54.5％；82例AL患者中有6例P16基因缺失，缺失率為7.3％，AML、ALL分別為1.7％和20.8％；16例健康自愿者或非惡性血液病患者P16基因則未發(fā)生甲基化或缺失；2.與對(duì)照組相比，不同濃度EGCG作用后均可抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化，G0-G1期細(xì)胞比例增加；3.E

4、GCG作用72h后P16基因甲基化程度明顯減弱，P16基因異常甲基化的現(xiàn)象被逆轉(zhuǎn)；4．未處理組細(xì)胞P16基因不表達(dá)，EGCG作用72h后P16基因在mRNA和蛋白水平表達(dá)增強(qiáng)；5．與未處理組相比，EGCG作用72h后甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A、DNMT3B的表達(dá)下降并呈濃度依賴性，而DNMTl表達(dá)不受影響。 結(jié)論：1.P16基因甲基化在成人急性白血病中有較高的檢測(cè)率，且復(fù)發(fā)患者檢出率較初治者高，可能與成人急性白血病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)