人乳頭瘤病毒檢測(cè)及分型基因芯片制備的初步研究.pdf

1、背景和目的:由于基因芯片技術(shù)可以對(duì)大量的生物樣品進(jìn)行平行、快速、敏感、高效的基因分析,因而在DNA序列測(cè)定、基因表達(dá)分析、基因組研究、基因診斷、藥物研究與開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用.近年來(lái),隨著基因芯片技術(shù)的日漸成熟,其在病原微生物的基因診斷中也得到了廣泛應(yīng)用,并對(duì)病原微生物的基因診斷起著革命性的影響.該實(shí)驗(yàn)將基因芯片技術(shù)應(yīng)用于HPV的檢測(cè)與分型,建立了一種新的HPV檢測(cè)與分型方法,探討了4種常見(jiàn)HPV(6,11,16,18)檢測(cè)及分型基

2、因芯片的制作方法,優(yōu)化確定了該芯片的最佳檢測(cè)條件.材料和方法:收集尖銳濕疣(50例)和宮頸癌(22例)石蠟包埋組織標(biāo)本,用酚-氯仿抽提法從中提取DNA,用HPV-PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)其進(jìn)行HPV檢測(cè),對(duì)結(jié)果陽(yáng)性者進(jìn)行純化、重組克隆,經(jīng)DNA序列測(cè)定,檢索GenBank,保留HPV6,11,16,18陽(yáng)性克隆為標(biāo)準(zhǔn)品.根據(jù)HPV L1區(qū)基因序列特點(diǎn),設(shè)計(jì)5條實(shí)驗(yàn)組探針(HPV通用探針、HPV6,11,16,18型特異性探針各一條)和3條對(duì)照

3、組探針(與HPV沒(méi)有同源性的一段植物基因?yàn)殛幮詫?duì)照,一段乙肝基因片段為陽(yáng)性對(duì)照,不含任何基因片段的空白點(diǎn)樣液為空白對(duì)照),用GMS 417 Arrayer點(diǎn)樣儀將其點(diǎn)樣至經(jīng)特殊處理過(guò)的玻片上,制成HPV檢測(cè)及分型基因芯片.采用PCR引物直接標(biāo)記法和摻入法對(duì)HPV標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行擴(kuò)增和熒光標(biāo)記,將標(biāo)記好的標(biāo)準(zhǔn)品與芯片在梯度溫度下(43℃,45℃,47℃,49℃,51℃)雜交1小時(shí),用GMS 418 Array Scanner掃描儀對(duì)雜交后的芯片

4、進(jìn)行掃描檢測(cè)分析,用ScanArray軟件對(duì)各信號(hào)點(diǎn)進(jìn)行信號(hào)強(qiáng)度采集.采用SPSS10.0軟件對(duì)不同標(biāo)記方法、不同雜交溫度下信號(hào)強(qiáng)度的差異性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn),以a=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),確定該芯片的最佳雜交溫度和樣品的最佳標(biāo)記方法.結(jié)論:1.該研究發(fā)現(xiàn),PCR引物直接標(biāo)記法為理想的樣品標(biāo)記方法;最佳雜交檢測(cè)溫度為47℃.2.該研究制作的HPV檢測(cè)及分型基因芯片是一種敏感、高效、快速、準(zhǔn)確的HPV檢測(cè)及分型方法,可以成功地