制備炭疽芽胞桿菌檢測基因芯片的初步研究.pdf

1、該研究以炭疽芽胞桿菌的毒素質(zhì)粒pXO1和莢膜質(zhì)粒pXO2為原材料,根據(jù)GenBank中兩個質(zhì)粒的特異性基因序列信息,設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增了質(zhì)粒pXO1上的特異性基因pagA、lef cya和pXO2上的特異性基因CapB.分別以炭疽芽胞桿菌的毒素質(zhì)粒pXO1和莢膜質(zhì)粒pXO2以及其上的特異性基因?yàn)樵牧?使用限制性內(nèi)切酶Sau3AI酶切質(zhì)粒pXO1和pXO2及特異性基因,酶切片段經(jīng)TaqDNA聚合酶72℃補(bǔ)平加A,并與T載體連接,后轉(zhuǎn)化感受態(tài)

2、細(xì)胞.一次PCR初步鑒定并篩選出炭疽芽胞桿菌DNA片段的陽性克隆.采用牙簽插膠的方法回收一次PCR產(chǎn)物并以此為模板進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增,以減少探針?biāo)ㄈ哂嗟腡載體序列,制備純凈的炭疽芽胞桿菌基因芯片探針.實(shí)驗(yàn)中共收集了294個陽性克隆探針,并打印在經(jīng)過氨基化修飾的玻片上,制成炭疽芽胞桿菌DNA芯片.此外,根據(jù)炭疽芽胞桿菌毒素質(zhì)粒pXO1和莢膜質(zhì)粒pXO2的基因序列信息,并按照寡核苷酸探針設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)了檢測炭疽芽胞桿菌的60mer寡核苷酸

3、特異性探針,并使用DMSO作為點(diǎn)樣液,將20條60mer特異性寡核苷酸探針打印在經(jīng)過多聚賴氨酸包被的DAKO硅烷化玻片上,制成檢測炭疽芽胞桿菌的寡核苷酸基因芯片.分別提取蘇云金(Bacillus thuringiensis)、蠟樣(Bacilluscereus)、枯草(Bacillus subtilis)芽胞桿菌及正常人血液總DNA,以限制性顯示技術(shù)標(biāo)記細(xì)菌、正常人血液總DNA及炭疽芽胞桿菌的兩個質(zhì)粒DNA并與炭疽芽胞桿菌DNA芯片進(jìn)行