對蝦病原檢測基因芯片的設計與初步研制.pdf

1、隨著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，其病害也日益嚴重，對蝦病害種類越來越多。病毒、細菌、立克次氏體、真菌等多種病原都能感染對蝦，據(jù)不完全統(tǒng)計，目前已發(fā)現(xiàn)50多種能感染對蝦的病原，引起養(yǎng)殖對蝦發(fā)病死亡，并且往往不是單一病原感染，病毒感染不僅常伴有細菌，而且可能是多種病毒同時感染。為此建立高通量、高速度、高靈敏度的對蝦病原微生物檢測技術顯得格外重要。本文分析篩選了對蝦病原核酸序列后，設計和初步研制了能同時檢測多種對蝦病原的基因芯片技術。 根據(jù)

2、Lightner藍皮書和我國養(yǎng)殖對蝦的主要病害，選擇對蝦的9種病毒、6種細菌、1種真菌和1種立克次氏體為研究對象，在NCIBI中分別檢索他們的核酸序列，進行BLAST搜索比對，Omiga軟件Alignment多重比對，找出各種病原核酸序列的保守區(qū)和特異區(qū)序列，將篩選確定的各條序列，同時導入到微陣列(microarray)專門的引物和探針設計軟件.AlleleID 3.0，根據(jù)引物和探針設計原則，在同一個任務下批量設計出退火溫度等各項參數(shù)

3、十分相似，擴增片段長度為200-500bp的引物。再根據(jù)擴增片段序列，設計長度為57bp的寡核苷酸探針。將設計好的引物和探針再通過BLAST搜索篩選確定其特異性后，由生物公司合成。本研究針對選擇的研究對象，共設計了43對引物和43條相對應的寡核苷酸探針。其中包括以宿主對蝦序列為模板設計的引物和探針，用來作為陽性對照。 本文先針對部分引物進行了特異性驗證實驗，所采用的9對特異性引物，分別以含有WSSV、IHHNV、副溶血弧菌、創(chuàng)傷

4、弧菌、哈維氏弧菌、溶藻膠弧菌DNA為模板，均能特異性的PCR擴增出與實驗設計相符的產(chǎn)物，同時驗證了用來作為檢測DNA病原的陽性對照。通過建立一步法RT-PCR方法，也驗證了為檢測RNA病毒的陽性對照。之后，采用同步。PCR方法和一步法RT-PCR方法對各個目標序列進行地高辛標記，并測定標記濃度為80ng/μl-100ng/μl。 將合成后的探針按照設定的位置分布用手動點樣儀點在帶正電的尼龍膜上，經(jīng)紫外交聯(lián)后固定在膜上組成寡核苷酸

5、膜芯片。將DIG標記的擴增產(chǎn)物與膜芯片雜交實驗中，首先驗證了芯片上的寡核苷酸探針的雜交的特異性，無交叉雜交反應。之后設計了芯片上寡核苷酸探針的濃度梯度，與芯片雜交的DIG標記產(chǎn)物濃度梯度以及雜交時間梯度實驗，進行芯片雜交靈敏度的摸索和雜交條件優(yōu)化。結果顯示：芯片上的寡核苷酸濃度為20μmol/L即能與DIG標記產(chǎn)物發(fā)生明顯的陽性顯色反應；芯片能檢測到16ng/μl濃度的DIG標記產(chǎn)物，推算芯片的能檢測到60pg對蝦病原DNA和80pg的