海水養(yǎng)殖動(dòng)物部分病原檢測(cè)基因芯片的初步設(shè)計(jì).pdf

1、病害嚴(yán)重威脅海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，如何尋求一種有效的途徑來緩解病害給養(yǎng)殖業(yè)帶來的危害與損失，一直是人們所關(guān)注的問題?，F(xiàn)有的病原檢測(cè)技術(shù)局限性大、效率低、系統(tǒng)性差，急需一種海水養(yǎng)殖動(dòng)物疾病高通量檢測(cè)手段進(jìn)行策略上的改進(jìn)，打破技術(shù)瓶頸。隨著水產(chǎn)動(dòng)物病原基礎(chǔ)信息數(shù)據(jù)的日漸豐富，水產(chǎn)動(dòng)物疾病診斷技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)不可避免地向著高通量技術(shù)方向跨越。 本論文根據(jù)Lightner藍(lán)皮書、國(guó)際獸疫局(OIE)水生動(dòng)物疾病名錄、亞太水產(chǎn)養(yǎng)殖中心網(wǎng)絡(luò)

2、(NACA)水生動(dòng)物疾病名錄等，選擇海水養(yǎng)殖鰈形目魚類、鱸形目魚類、對(duì)蝦類和雙殼貝類等宿主的主要病毒、真菌、原生動(dòng)物等幾十種病原微生物作為研究對(duì)象，包括14類魚病毒、14類對(duì)蝦病毒、魚立克次氏體、3類真菌以及8類原生動(dòng)物。針對(duì)這些研究對(duì)象，在Genbank中共檢索收集了27969條相關(guān)基因序列，包括海水養(yǎng)殖動(dòng)物的病原序列26861條，質(zhì)控系統(tǒng)所需序列1108條。 把在Genbank中分別檢索到病原微生物的核酸序列，進(jìn)行BLAST

3、搜索比對(duì)，Omiga軟件Alignment多重比對(duì)，找出各種病原核酸序列的保守區(qū)和特異區(qū)序列，將篩選確定的各條序列按照宿主的不同，分3類同時(shí)導(dǎo)入到微陣列專業(yè)的引物和探針設(shè)計(jì)軟件AlleleID6.0中，根據(jù)引物和探針設(shè)計(jì)原則，在同一個(gè)任務(wù)下批量設(shè)計(jì)出退火溫度等各項(xiàng)參數(shù)十分相似，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為200～500bp的引物。再根據(jù)擴(kuò)增片段序列，設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為57bp的寡核苷酸探針。將設(shè)計(jì)好的探針再全部導(dǎo)入Omiga軟件進(jìn)行比對(duì)，確定探針之間最多不超

4、過四個(gè)連續(xù)堿基相同，而且位置處于引物擴(kuò)增區(qū)，與引物沒有結(jié)合位點(diǎn)，然后交由上海生工合成。 本研究中針對(duì)選擇的研究對(duì)象，共設(shè)計(jì)了檢測(cè)魚類病原包括備選引物和探針在內(nèi)的31對(duì)引物和31條相對(duì)應(yīng)的寡核苷酸探針，檢測(cè)對(duì)蝦類病原的37對(duì)引物和37條相對(duì)應(yīng)的寡核苷酸探針，檢測(cè)雙殼貝類病原的8對(duì)引物和8條相對(duì)應(yīng)的寡核苷酸探針。另外還有以宿主序列為模板設(shè)計(jì)的引物和探針；用來組成質(zhì)控體系中全程監(jiān)控的陽性內(nèi)對(duì)照，以及由非同源性宿主序列為模板設(shè)計(jì)的引物和

5、探針，用來組成質(zhì)控體系中的陽性外對(duì)照。 根據(jù)引物和探針的設(shè)計(jì)結(jié)果，按照病原微生物感染宿主的不同，采用基因芯片的原理，將設(shè)計(jì)合成后的探針按照預(yù)先設(shè)計(jì)的點(diǎn)陣分布用手動(dòng)點(diǎn)樣儀在尼龍膜上點(diǎn)樣，經(jīng)紫外交聯(lián)后固定在膜上制備成寡核苷酸膜芯片。病原檢測(cè)膜芯片分為魚類病原檢測(cè)芯片、對(duì)蝦類病原檢測(cè)芯片和雙殼貝類病原檢測(cè)芯片。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室保存和課題合作單位提供的魚類和對(duì)蝦類的陽性病料，本文先針對(duì)部分引物進(jìn)行了特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在魚類芯片中，所設(shè)

6、計(jì)的9對(duì)特異性引物，分別以含有EHNV、LCDV、TRBIV、LYCIV、ISKNV、RGNNV、IHNV、VHSV、IPNV和YAV的DNA或cDNA為模板，均能特異性的PCR擴(kuò)增出與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的產(chǎn)物；在對(duì)蝦類芯片中，所設(shè)計(jì)的8對(duì)特異性引物，分別以含有WSSV、IHHNV和TSV的DNA或cDNA為模板，均能特異性的PCR擴(kuò)增出與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的產(chǎn)物；同時(shí)驗(yàn)證了質(zhì)控體系中的陽性內(nèi)對(duì)照及陽性外對(duì)照引物對(duì)。之后，采用同步PCR方法和兩步法

7、RT-PCR方法，用基因特異性引物加入地高辛標(biāo)記的dUTP擴(kuò)增并標(biāo)記各個(gè)目標(biāo)序列，標(biāo)記后的PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢查后測(cè)定標(biāo)記產(chǎn)量，并測(cè)定標(biāo)記濃度為10 ng/μl-40 ng/μl之間。將DIG標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物分別與魚類病原檢測(cè)膜芯片和對(duì)蝦類病原檢測(cè)膜芯片進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，雜交結(jié)束后的反應(yīng)信號(hào)用NBT-BCIP液顯色后進(jìn)行分析，驗(yàn)證了魚類病原檢測(cè)膜芯片上11條寡核苷酸探針的雜交特異性，包括3條質(zhì)控系統(tǒng)的探針和8條分別檢測(cè)EHNV、

8、LCDV、TRBIV、LYCIV、ISKNV、RGNNV、IHNV、VHSV、IPNV和YAV的探針；對(duì)蝦類病原檢測(cè)膜芯片上12條寡核苷酸探針，包括4條質(zhì)控系統(tǒng)的探針和8條分別檢測(cè)WSSV、IHHNV、TSV病原的探針。之后，采用膜芯片檢測(cè)人工合成的ISAV和MBV基因以及從河北唐山取樣的發(fā)病對(duì)蝦樣品，又成功驗(yàn)證了魚類病原檢測(cè)芯片上ISAV探針和對(duì)蝦病原檢測(cè)芯片上MBV和HPV探針。 本文最后對(duì)基因芯片技術(shù)應(yīng)用于海水養(yǎng)殖動(dòng)物病原