大菱鲆養(yǎng)殖環(huán)境細(xì)菌多樣性分析及水產(chǎn)病原菌基因芯片檢測(cè)體系的構(gòu)建.pdf

1、為完善水產(chǎn)病害預(yù)警監(jiān)測(cè)機(jī)制，本文在使用宏基因組測(cè)序技術(shù)、分離培養(yǎng)及分子靶標(biāo)鑒定等手段對(duì)海水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的致病菌或潛在病原菌存在情況、大菱鲆幼魚(yú)腸道及其養(yǎng)殖環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究的同時(shí)，針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖高度集約化趨勢(shì)及水產(chǎn)病害頻發(fā)的現(xiàn)狀，結(jié)合歷史文獻(xiàn)資料，嘗試構(gòu)建檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)通量大且較為經(jīng)濟(jì)的病原菌基因芯片技術(shù)，為實(shí)現(xiàn)工廠化養(yǎng)殖過(guò)程中的疾病監(jiān)測(cè)和預(yù)警提供技術(shù)支持。
　　本論文對(duì)2013~2014年間發(fā)生在山東膠南的大菱鲆幼魚(yú)腹水癥病原

2、菌進(jìn)行分離鑒定。結(jié)果從三批患腹水病的幼魚(yú)體內(nèi)分離多種優(yōu)勢(shì)菌株，經(jīng)人工感染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有一株菌株能夠使大菱鲆幼魚(yú)產(chǎn)生腹水、死亡現(xiàn)象，經(jīng)過(guò)16S rRNA基因、gyrB基因測(cè)序比對(duì)，將該株菌鑒定為銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa，其半致死濃度為3.6×108 CFU·mL-1，此為首次報(bào)道該菌能夠感染大菱鲆幼魚(yú)。
　　以溶血為表征對(duì)山東近岸養(yǎng)殖環(huán)境中的潛在條件致病菌進(jìn)行的篩查結(jié)果為：從養(yǎng)殖環(huán)境中分離鑒定出19株溶

3、血弧菌，以屬于燦爛支系（11/19）、哈維支系（6/19）的弧菌居多，且存在多種已報(bào)道的水產(chǎn)病原菌，如哈維氏弧菌、溶藻弧菌、歐文氏弧菌等。通過(guò)人工感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩株歐文氏弧菌、一株哈維氏弧菌表現(xiàn)出一定的毒力，并經(jīng)過(guò)毒力基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該三株菌均含有哈維氏弧菌溶血素編碼基因vhhB的同源基因，說(shuō)明在近岸養(yǎng)殖環(huán)境中存在潛在的條件致病菌。此外通過(guò)對(duì)分離弧菌的分子鑒定靶標(biāo)比較，發(fā)現(xiàn)鐵攝取調(diào)節(jié)蛋白編碼基因fur顯示出較好的分類(lèi)靶標(biāo)作用，可以作為弧菌屬分

4、子鑒定的靶標(biāo)基因。
　　通過(guò)對(duì)大菱鲆幼魚(yú)腸道及其養(yǎng)殖環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，相比于大菱鲆幼魚(yú)腸道，養(yǎng)殖水體中細(xì)菌多樣性更高，其中假交替單胞菌屬Pseudoalteromonas、交替單胞菌目某屬u(mài)nclassified Alteromonadales、假單胞菌屬Pseudomonas、弧菌屬Vibrio、別弧菌屬Aliivibrio的比例較為一致；而在大菱鲆樣本中弧菌屬占優(yōu)勢(shì)地位，其次為假單胞菌屬。
　　在結(jié)合上述研究結(jié)果

5、和結(jié)合文獻(xiàn)資料分析的基礎(chǔ)上，本論文構(gòu)建了能夠檢測(cè)9種水產(chǎn)病原菌的31種基因的基因芯片，經(jīng)檢測(cè)其探針特異性為100％，對(duì)親緣關(guān)系較近的菌株間沒(méi)有出現(xiàn)交叉反應(yīng)，通過(guò)對(duì)患病大菱鲆樣本檢測(cè)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)基因芯片檢測(cè)的靈敏度較好，能夠分辨出 PCR技術(shù)檢測(cè)不出的基因。此外基于多重 PCR技術(shù)，還對(duì)基因芯片檢測(cè)體系進(jìn)行優(yōu)化。確定當(dāng)雜交溫度為60℃、雜交時(shí)長(zhǎng)為2 h、探針濃度為4μmol·L-1、Cy3標(biāo)記的隨機(jī)引物的用量為150 pmol時(shí)，芯片的經(jīng)濟(jì)