養(yǎng)殖大菱鲆病原菌遲緩愛(ài)德華氏菌的分離鑒定及快速檢測(cè)技術(shù)的建立.pdf

1、大菱鲆(Scophthalmus maximus L)是一個(gè)經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的養(yǎng)殖品種，它生長(zhǎng)迅速并且味道十分鮮美，從而深受人們的喜愛(ài)。自從20世紀(jì)90年代從歐洲引入中國(guó)后，大菱鲆的養(yǎng)殖得到了很快的發(fā)展。然而，隨著養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化，使得大菱鲆的細(xì)菌性疾病不斷發(fā)生。愛(ài)德華氏菌病(edwardsiellosis)就是經(jīng)常發(fā)生的一種。 愛(ài)德華氏菌病是由遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda)引起的。遲緩愛(ài)德華氏菌，也被記為

2、遲鈍愛(ài)德華氏菌或緩慢愛(ài)德華氏菌，屬腸桿菌科，是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖中極具危害性的病原菌。在魚(yú)類中，遲緩愛(ài)德華氏菌有著廣譜的宿主范圍，能夠感染多種淡水和海水魚(yú)類，包括牙鲆、鰻鱺、真鯛、虹鱒、鯔魚(yú)和羅非魚(yú)等，其感染造成魚(yú)類出血性敗血癥以及內(nèi)臟組織的壞死等病癥，最終導(dǎo)致患魚(yú)死亡，統(tǒng)稱為愛(ài)德華氏菌病。另外，遲緩愛(ài)德華氏菌還可感染鳥(niǎo)類、哺乳動(dòng)物及爬行動(dòng)物等；也有造成人類胃和腸道感染的報(bào)道。 2006年夏季和秋季，山東省膠南和昌邑一帶的許多海水養(yǎng)殖

3、場(chǎng)養(yǎng)殖大菱鲆發(fā)生暴發(fā)性傳染病，肉眼能觀察到的癥狀為眼睛腫脹、有炎癥、有出血點(diǎn)、有腹水和粘性液體。經(jīng)分離得到一株致病菌，命名為L(zhǎng)TB-4。病原菌的主要特征是：革蘭氏染色陰性，短棒狀，大小(0.5～0.9)×(1.0～2.0)μm，無(wú)鞭毛，吲哚、硫化氫、賴氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶和葡萄糖陽(yáng)性，VP反應(yīng)陰性，不能利用丙二酸、蔗糖、甘露醇、山梨醇、鼠李糖和蜜二糖。腹腔注射大菱鲆的半數(shù)致死量為3×103 cfu/mL。16Sr DNA序列比對(duì)和構(gòu)

4、建進(jìn)化樹(shù)表明LXB-4與遲緩愛(ài)德華氏菌相似度最高。結(jié)合其他的鑒定手段包括形態(tài)觀察、生理生化指標(biāo)，判定這株菌為鞭毛缺失型遲緩愛(ài)德華氏菌。這是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道鞭毛缺失型遲緩愛(ài)德華氏菌。使用gyrB基因的通用引物擴(kuò)增了LTB-4和ET2034(遲緩愛(ài)德華氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株)的部分片段并測(cè)序，通過(guò)比對(duì)設(shè)計(jì)遲緩愛(ài)德華氏菌gyrB基因的特異性引物。PCR結(jié)果表明可以在3h內(nèi)結(jié)束，除了遲緩愛(ài)德華氏菌LTB-4和ET2034能擴(kuò)增出特異性片段，其他對(duì)照菌株都為陰

5、性：PCR的檢測(cè)閾值是4.0×104 cfu/mL。用遲緩愛(ài)德華氏菌WY28作為抗原，免疫新西蘭兔，獲得效價(jià)為1:2048的多克隆抗體；以此多克隆抗體作為一抗，山羊抗兔IgG-HRP作為酶標(biāo)二抗，建立遲緩愛(ài)德華氏菌的間接ELISA快速檢測(cè)法。采用棋盤(pán)滴定法確定抗原與一抗的最佳工作濃度分別為106 cfu/mL和1:10000；酶標(biāo)二抗的最適工作濃度為1:1000。將該方法標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，交叉實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此多克隆抗體與腸桿菌科的其