犢牛腹瀉病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

1、1犢牛腹瀉病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位專家鄧立新摘要：商丘某肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)大量犢牛發(fā)生腹瀉，為了研究引起犢牛腹瀉的病原菌，本試驗(yàn)從商丘某肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)無(wú)菌采集腹瀉犢牛的新鮮糞便，進(jìn)行細(xì)菌的增菌培養(yǎng)、純化、質(zhì)譜試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明，分離的細(xì)菌在形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性、耐藥性等方面與大腸埃希氏菌、沙門(mén)氏菌、克雷伯氏菌基本相同，通過(guò)質(zhì)譜鑒定為大腸埃希氏菌、沙門(mén)氏菌和克雷伯氏菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明該分離菌對(duì)氨卡西林、青霉

2、素等耐藥，對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、恩諾沙星等敏感。試驗(yàn)結(jié)果為臨床用藥及預(yù)防提供了理論依據(jù)。關(guān)鍵詞：犢牛腹瀉；細(xì)菌分離鑒定；飛行時(shí)間質(zhì)譜；藥敏試驗(yàn)犢牛腹瀉是新生犢牛常發(fā)的一種急性腹瀉，引起犢牛腹瀉的病因很多，包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)等病原微生物以及營(yíng)養(yǎng)因素和環(huán)境因素等[1]。僅大腸埃希菌病造成的死亡，就占肉用犢牛死亡總數(shù)的75%，該病的發(fā)生嚴(yán)重影響著犢牛的生長(zhǎng)發(fā)育和成年后的生產(chǎn)性能，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。此外，由于臨床中抗菌藥物的

3、大量應(yīng)用，甚至濫用，導(dǎo)致了大腸埃希菌等細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和擴(kuò)散，給犢牛腹瀉病的防治造成了一定困難，而且動(dòng)物源性帶耐藥質(zhì)粒的腸道菌可通過(guò)畜禽產(chǎn)品的加工、食用等過(guò)程傳播到人類，對(duì)人類健康具有潛在性危害[3]。但由于近年來(lái)隨著質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，軟電離方式的出現(xiàn)，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)、核酸及脂類等生物大分子進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析，進(jìn)而使得其被應(yīng)用于細(xì)菌的檢測(cè)及鑒定[45]。本試驗(yàn)從河南省民權(quán)縣某肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)無(wú)菌采集腹瀉犢牛糞

4、便病料，進(jìn)行病原分離，對(duì)分離菌株進(jìn)行分離培養(yǎng)、鏡檢、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)及飛行時(shí)間質(zhì)譜試驗(yàn)，希望為犢牛腹瀉病的防治提供依據(jù)。1材料與方法1.1材料1.1.1試驗(yàn)地點(diǎn)、時(shí)間本試驗(yàn)從2015年1月至4月間在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。1.1.2病料棉拭子無(wú)菌采集民權(quán)縣某肉牛場(chǎng)腹瀉犢牛糞便。1.1.3主要試劑藥敏片購(gòu)自于杭州濱和微生物試劑有限公司，規(guī)格為5μg片、20片瓶，藥敏稀釋法所用的藥物由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供（青霉素鈉、頭孢噻呋鈉、頭孢吡肟

5、、氨卡西林鈉、硫酸慶大霉素、泰妙菌素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、阿莫西林、鹽酸四環(huán)素、氟苯尼考、多西環(huán)素），藥物濃度為512mgml；麥康凱培養(yǎng)基（MK），SS瓊脂培養(yǎng)基，普通肉湯培養(yǎng)基，普通瓊脂培養(yǎng)基，MHB瓊脂培養(yǎng)基，三糖鐵培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基均按常規(guī)方法配制[6]。95%酒精，革蘭氏染液，甲基紅，1%氫氧化鈉溶液等指示劑。1.1.4主要儀器設(shè)備顯微鏡（JnoecXS212202）、恒溫培養(yǎng)箱、烘干箱、高壓滅菌鍋、冰箱(海爾)等。1.2方法

6、1.2.1病料處理將采集的病料接種于普通肉湯培養(yǎng)基中在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24h。1.2.2細(xì)菌的分離培養(yǎng)3圖1藥敏試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法圖2藥敏試驗(yàn)稀釋法Fig1.SusceptibilitytestdiscdiffusionmethodFig2.Drugsensitivetestdilutionmethod2結(jié)果與分析2.1分離菌培養(yǎng)特性(1)分離菌1在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，形成邊緣整齊、圓形、灰白色、半透明的菌落。在麥康凱瓊脂培養(yǎng)

7、基上形成粉紅色、圓形、隆起、表面光滑、邊緣整齊的菌落。在SS瓊脂培養(yǎng)基上形成紫紅色菌落。革蘭染色鏡檢為陰性，兩端鈍圓的小桿菌（圖4）。(2)分離菌2在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，形成圓形、表面光滑、無(wú)色半透明、邊緣整齊的菌落。在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成無(wú)色或淺黃色、圓形菌落。在SS瓊脂培養(yǎng)基上形成無(wú)色或黃色、圓形菌落。革蘭染色鏡檢為陰性，兩端鈍圓的短桿菌（圖3）。(3)分離菌3在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成圓形、隆起、表面光滑濕潤(rùn)、豐厚黏稠的大