羅非魚病原菌分離鑒定及不同品系間抗病力的初步比較.pdf

1、羅非魚是聯(lián)合國(guó)糧食和農(nóng)業(yè)組織推薦的養(yǎng)殖品種；中國(guó)是世界上最大的羅非魚養(yǎng)殖國(guó)之一，近年來年產(chǎn)量均在120萬(wàn)噸以上，約占世界總產(chǎn)量的50％，羅非魚已經(jīng)形成產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展模式。目前，我國(guó)有11個(gè)具有穩(wěn)定遺傳性狀的純系及雜交養(yǎng)殖品種，其中以吉富和奧尼品種的養(yǎng)殖最為廣泛。隨著羅非魚養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，2007年以來羅非魚大規(guī)模暴發(fā)病逐漸盛行。調(diào)查表明：不同養(yǎng)殖規(guī)格、不同養(yǎng)殖階段的羅非魚發(fā)病狀況各有不同。病原主要為細(xì)菌，包括嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、

2、無(wú)乳鏈球菌以及海豚鏈球菌。
　　 2010年4月～6月，廣東省羅非魚魚苗(體長(zhǎng)6～14cm)大規(guī)模暴發(fā)性出血病，從發(fā)病羅非魚分離到多種病原菌，其中優(yōu)勢(shì)病原鑒定為溫和氣單胞菌。通過對(duì)近年來廣東、海南大規(guī)模羅非魚暴發(fā)病病原進(jìn)行分析，2009年和2010年連續(xù)兩年的7月～10月前后，導(dǎo)致廣東、海南兩省成魚發(fā)生大規(guī)模暴發(fā)病的病原為無(wú)乳鏈球菌。藥物敏感性試驗(yàn)顯示，無(wú)乳鏈球菌各地分離株之間存在差異。羅非魚常見病原菌溫和氣單胞菌、無(wú)乳鏈球菌、

3、嗜水氣單胞菌及最小弧菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)氯霉素和諾氟沙星都敏感。氯霉素為漁用禁藥，其替代物氟苯尼考對(duì)無(wú)乳鏈球菌的最小抑菌濃度為1.69mg·mL-1。鏈球菌是近兩年危害羅非魚成魚的頭號(hào)病原，氟苯尼考為畜牧水產(chǎn)允許使用的藥物，可作為羅非魚細(xì)菌性病害防治的首選藥物之一。
　　 為了研究滲透壓和鹽度對(duì)病原菌增殖的影響，將羅非魚常見病原接種于NaCl梯度為0.05％，0.55％，1.05％，1.55％，2.05％，2.55％，3.0

4、5％，3.55％，4.05％，4.55％的腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基，接種濃度為2.0Mcf菌懸浮液，培養(yǎng)15～48h后，用麥?zhǔn)媳葷岱y(cè)定菌濃度，NaCl濃度由0.05％增加到0.55％，無(wú)乳鏈球菌、海豚鏈球菌、溫和氣單胞菌及愛德華氏菌的增殖量顯著降低，嗜水氣單胞菌增殖無(wú)明顯變化。NaCl濃度≥1.05％時(shí)，海豚鏈球菌基本不增殖。NaCl濃度在0.55％～1.55％范圍內(nèi)，NaCl濃度增加，無(wú)乳鏈球菌、溫和氣單胞菌及愛德華氏菌的增殖量都顯

5、著降低(P<0.05)。NaCl濃度在1.55％～2.05％范圍內(nèi)，溫和氣單胞菌和愛德華氏菌增殖量顯著下降，無(wú)乳鏈球菌和嗜水氣單胞菌增殖量無(wú)明顯變化。NaCl濃度在2.05％～2.55％范圍內(nèi)，無(wú)乳鏈球菌、溫和氣單胞菌和嗜水氣單胞菌增殖隨鹽度增加顯著降低，愛德華氏菌無(wú)顯著變化。NaCl濃度在2.55％～3.05％范圍內(nèi)，無(wú)乳鏈球菌和溫和氣單胞菌增殖量隨鹽度增加顯著降低，嗜水氣單胞菌和愛德華氏菌增殖量無(wú)顯著變化。環(huán)境因素對(duì)病原菌的增殖有一

6、定的影響。環(huán)境因子的變化，可能對(duì)養(yǎng)殖水體微生物生態(tài)構(gòu)成造成顯著的影響。咸水養(yǎng)殖還可以改善魚類肉質(zhì)和口味，發(fā)展咸水養(yǎng)殖羅非魚對(duì)降低當(dāng)前病害對(duì)羅非魚養(yǎng)殖造成的風(fēng)險(xiǎn)可能有一定的應(yīng)用意義。
　　 早期研究表明，水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)暴發(fā)疾病的抵抗能力存在物種問差異。用嗜水氣單胞菌浸泡感染體長(zhǎng)為7～8cm，9.0～9.5cm，11.5～12.5cm階段的奧利亞、尼羅、奧尼、吉富、莫荷五個(gè)品系羅非魚，樣本量為50～80尾/組，采取少量多次試驗(yàn)的方式，每

7、箱每個(gè)品系羅非魚5～10尾。密度為25～40尾/池，養(yǎng)殖環(huán)境為室內(nèi)1m×0.5m的水族箱、水深0.5m，水溫23～28℃，持續(xù)曝氣，菌感染濃度為2.7×107cfu·mL-1～1.2×108cfu·mL-1，記錄累計(jì)死亡率。分別測(cè)定規(guī)格為11.5～12.5cm的五個(gè)品系羅非魚在微流水養(yǎng)殖條件下的血清溶菌酶、超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)、一氧化氮酶、過氧化物酶等非特異性免疫指標(biāo)，同時(shí)測(cè)定嗜水汽單胞菌浸泡感染后5日和10日

8、存活實(shí)驗(yàn)魚的血清溶菌酶、堿性磷酸酶含量。結(jié)果顯示：連續(xù)觀察10日，體長(zhǎng)為5.0～7.0cm規(guī)格的實(shí)驗(yàn)魚累計(jì)死亡率分別為莫荷羅非魚(♀0.mossambica×♂0.hornorum)53.33％、奧尼羅非魚(♀0.aureus×♂0.niloticus)63.33％、吉富羅非魚(0.niloticus，GIFTstrain)86.67％；連續(xù)觀察6日，體長(zhǎng)為9.0～9.5cm規(guī)格的實(shí)驗(yàn)魚累積死亡率分別為尼羅的52.0％、奧尼62.2％、

9、莫荷68.0％、奧利亞70.0％、吉富78.0％；連續(xù)觀察6日，體長(zhǎng)為11.5～12.5cm規(guī)格的實(shí)驗(yàn)魚累積死亡率分別為奧利亞26.3％、奧尼32.5％、吉富37.5％、莫荷60.0％。11.5～12.5cm規(guī)格的莫荷羅非魚和奧利亞羅非魚在嗜水氣單胞菌浸泡感染5d和10d后溶菌酶含量呈上升趨勢(shì)，而堿性磷酸酶(AKP)含量維持不變。無(wú)乳鏈球菌注射感染體長(zhǎng)為8.5～10.0cm規(guī)格的五個(gè)品系羅非魚，連續(xù)觀察10日，累計(jì)死亡率分別為尼羅羅非魚

10、46.7％、奧利亞羅非魚60.0％、莫荷羅非魚66.7％、奧尼羅非魚93.3％、吉富羅非魚93.3％。綜合分析以上數(shù)據(jù)，奧尼羅非魚整體上存活率相對(duì)較高，奧尼羅非魚可能是實(shí)際生產(chǎn)中生長(zhǎng)速度和抗病力都比較均衡的品種。
　　 為后續(xù)建立單克隆抗體檢測(cè)方法及羅非魚免疫相關(guān)研究，采用一種簡(jiǎn)易快速的A蛋白親和層析法，從個(gè)五品系育成期羅非魚(30～50g)血液中分離純化免疫球蛋白。結(jié)合緩沖液為pH7.4的PBS，結(jié)合溫度4℃，洗脫緩沖液為pH