大菱鲆遲緩愛德華氏菌抗體檢測試紙條的研制及應(yīng)用.pdf

1、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)隸屬于腸桿菌科，愛德華氏菌屬，是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，呈短桿狀，兼性厭氧，具鞭毛及運動性。遲緩愛德華氏菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的常見致病菌之一，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的危害，對該病的及時診斷有利于降低損失?？贵w的快速檢測有助于疾病的早期預(yù)警及疫苗免疫效果的評價。目前常見的抗體檢測方法，如中和試驗、免疫凝集試驗、瓊脂擴散試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorben

2、t assay, ELISA)、抗體芯片技術(shù)、PCR技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)等均費時費力，本研究擬采用膠體金免疫層析原理制備遲緩愛德華氏菌抗體檢測試紙，以期得到一種準(zhǔn)確、靈敏、安全、花費低、快速的抗體檢測方法。
　　1.鲆鰈類8種常見致病菌滅活疫苗及其抗血清的制備
　　本研究采用甲醛滅活遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、哈維弧菌(Vibrio harvey

3、i)、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)、溶藻膠弧菌(Vibrio alginolyticus)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)，用滅活菌液與弗氏佐劑等體積混勻并乳化后制得各菌滅活疫苗，通過肌肉注射免疫大菱鲆獲得各菌的抗血清，大菱鲆接種遲緩愛德華氏菌滅活疫苗后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定抗血清，從第四周開始

4、能檢測出機體抗體，到第十周抗體水平達到最高，效價為1:102400，其他各菌滅活疫苗獲得的效價分別為1:6400、1:6400、1:12800、1:12800、1:6400、1:6400、1:12800。各菌與各抗血清的交叉反應(yīng)試驗結(jié)果顯示各菌與除自身外的抗血清存在一定的交叉反應(yīng)，但與自身抗血清反應(yīng)最為強烈。以上實驗結(jié)果表明本實驗制備的抗血清可以用于檢測本研究擬研制的試紙條的靈敏性與特異性。
　　2.大菱鲆免疫球蛋白IgM單克隆抗

5、體的制備與鑒定
　　本研究以純化的大菱鲆血清免疫球蛋白 IgM免疫小鼠，應(yīng)用細(xì)胞工程的方法生產(chǎn)融合的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)免疫學(xué)檢測篩選方法篩選出分泌大菱鲆免疫球蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，制備出大菱鲆 IgM單克隆抗體。采用免疫印跡及酶聯(lián)免疫吸附方法對單抗的效價、靈敏性及特異性進行檢測，結(jié)果顯示單抗識別純化的大菱鲆 IgM重鏈區(qū)，單抗與半滑舌鰨及草魚、鯉魚、鳙魚、鯽魚四種淡水魚類無交叉反應(yīng)，與鱸魚、六線、黑鮶、紅鰭東方鲀、牙鲆五種海水魚

6、類血清有一定的交叉反應(yīng)，但與大菱鲆的血清的反應(yīng)最為強烈，效價為1:1.024×106，對純化大菱鲆免疫球蛋白的靈敏度為32ng/ml，表明該單抗具有良好的靈敏性和特異性，可以用于試紙條的制備。
　　3.抗遲緩愛德華氏菌抗體膠體金檢測試紙條的研制及應(yīng)用
　　采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金，通過肉眼觀察及紫外分光光度計掃描，制備的膠體金顆粒均一，直徑為30nm。將膠體金調(diào)至弱堿性，用制備的膠體金標(biāo)記單抗，最佳標(biāo)記濃度為10μg/m

7、l，并采用Dot-Elisa法檢測金標(biāo)抗體，結(jié)果顯示金標(biāo)抗體能與抗遲緩愛德華氏菌抗體反應(yīng)。用 X-only單向噴點儀將金標(biāo)抗體均勻噴灑于用10％牛血清白蛋白處理過的玻璃纖維素膜上，干燥后制得金標(biāo)墊。同時用噴點儀將遲緩愛德華氏菌破碎液上清及葡萄球菌 A蛋白分別點射于硝酸纖維素膜(NC膜)上形成檢測線和對照線，組裝成試紙條。
　　對所研制的遲緩愛德華氏菌抗體檢測試紙條進行重復(fù)性、穩(wěn)定性、特異性及靈敏度檢驗試驗，并與ELISA結(jié)果對比。