免疫層析法檢測山羊傳染性胸膜肺炎抗體試紙條的研制.pdf

1、山羊傳染性胸膜肺炎(CCPP)是由山羊支原體山羊肺炎亞種(Mccp)引起的山羊的一種高度接觸性傳染病，是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)法定報告?zhèn)魅静≈弧＝鼛啄?，我國相繼在甘肅、山東等地分離或檢測到CCPP的病原體Mccp，表明該病在我國流行。準確診斷是是防治該病的前提條件之一。目前，國外已報道多種CCPP血清學診斷方法，如補體結(jié)合試驗、競爭ELISA試驗等，但多有諸如操作復雜、重復性或特異性差、需實驗室儀器等缺點，尤其不適合于我國動物疾病

2、診斷實際中快速、易于操作和適于基層使用的要求。免疫膠體金技術(shù)具有方便快捷、穩(wěn)定性強、特異、敏感、不需要特殊設(shè)備和試劑、結(jié)果判斷直觀、可以保存等優(yōu)點，在醫(yī)學和獸醫(yī)免疫診斷領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。因此，本研究運用膠體金免疫層析技術(shù)，建立一種快速、簡便、靈敏的檢測MCCP抗體的方法。
　　 本實驗用Mccp全菌為抗原，常規(guī)免疫健康家兔，間接血凝試驗檢測抗體效價達1:1024以上后收集兔血清，然后采用硫酸銨鹽析和Protein G抗體純化柱獲得兔

3、抗Mccp多克隆抗體，應(yīng)用十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法檢測其純度；采用MEM-KM2培養(yǎng)基擴大Mccp的培養(yǎng)，經(jīng)10000 r/min離心菌體，從上清液中提取Mccp莢膜多糖備用。
　　 采用檸檬酸三鈉還原法制備25nm的膠體金顆粒，膠體金標記純化后的Mccp，最佳標記量和最適pH值的測定結(jié)果分別為50μg/ml和7.0，低溫超速離心法純化標記好的金標抗原；用純化的Mccp分泌多糖抗原包被試紙條的檢測

4、線，最適劃線濃度為2.0 mg/ml，Mccp多克隆抗體用于質(zhì)控線的包被，最適劃線濃度為1.6 mg/ml。檢測試紙條對已知陽性和陰性血清進行實驗，檢測時間約10 min，陽性血清在檢測線和質(zhì)控線出現(xiàn)兩條明顯的紅色條帶，檢驗結(jié)果為陽性，而PBS在質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，在檢測線未出現(xiàn)，檢驗結(jié)果呈陰性，與預期設(shè)計的結(jié)果相符合。
　　 對試紙條進行了敏感性、重復性、特異性實驗。結(jié)果顯示：血清效價為1:1024的Mccp陽性血清稀釋80