遲緩愛德華氏菌侵襲與粘附相關基因的功能研究.pdf

1、遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）是一種革蘭氏陰性致病菌，具有廣泛的宿主范圍，包括魚類、兩棲類、爬行類及哺乳類，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，而且E. tarda是愛德華氏菌屬中唯一可以感染人的種類。目前為止，已經(jīng)報道粘附因子、對宿主免疫系統(tǒng)的抵抗力、鐵載體、溶血素、Ⅲ和Ⅵ型分泌系統(tǒng)都屬于E. tarda的致病因子，但是E. tarda的詳細致病機制還不明確。為預防和治療遲緩愛德華氏菌病，保障養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)展

2、，迫切需要對E. tarda的致病機理深入研究。
　　在許多病原菌的致病過程中，病原菌可通過侵入宿主上皮細胞而引發(fā)系統(tǒng)性感染。病原菌對宿主細胞的粘附和侵襲與多種毒力因子有關，包括侵襲素、粘附素、血凝素等。侵襲素主要由革蘭氏陰性致病菌產(chǎn)生，包括 N-端嵌在細菌外膜的β結構域和 C-端位于胞外與宿主細胞結合的結構域，在細菌侵入宿主細胞過程中發(fā)揮重要作用；粘附素與致病菌對宿主細胞的附著相關，一般包括菌毛粘附素和非菌毛粘附素；溫度敏感性血

3、凝素發(fā)現(xiàn)于禽病原性大腸桿菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC），也與細菌的致病性相關。
　　為了探索侵襲素、粘附素和溫度敏感性血凝素在E. tarda致病性中的作用，本研究利用overlap PCR和由自殺質(zhì)粒pRE112介導的二次同源重組成功構建了上述基因的缺失突變株Δinv、Δadh及Δtsh。首先，擴增inv、adh或tsh基因的上、下游片段，利用overlap PCR分別將其上下

4、游片段連接起來，克隆測序后與自殺質(zhì)粒pRE112連接，依次轉入大腸桿菌SY327和S17-1，并與E. tarda野生株H1進行接合；接合子中的重組質(zhì)粒與基因組發(fā)生二次同源重組后，利用含10％蔗糖的TSA平板進行篩選，得到不含自殺質(zhì)粒pRE112的inv、adh或tsh框內(nèi)缺失突變株。同時，將攜帶有inv基因全長片段及啟動子區(qū)域的表達質(zhì)粒pACYC184電轉化進入缺失突變株Δinv，構建了inv過量表達菌株inv+。最后，分別對上述突變

5、株和過量表達株相對于野生株E. tarda H1在生長、生物被膜形成能力、溶血活性、對EPC細胞的侵染能力、致病性、LPS合成以及胞外蛋白分泌等方面的性狀改變進行了比較分析。結果表明：
　　(1)與野生株H1相比，Δinv與inv+生長速度基本沒有變化；Δinv對E. tarda生物被膜形成能力、溶血活性以及對 EPC細胞內(nèi)化能力均明顯降低，而 inv+則明顯增強；Δinv對斑馬魚的致病性降低，而 inv+則回復到野生株的水平；Δ

6、inv與inv+對LPS的合成以及ECP的分泌沒有影響。
　　(2)粘附素缺失突變株Δadh生長速度沒有變化，但是對氨基糖苷類抗生素（卡那霉素、新霉素）和四環(huán)素類抗生素（四環(huán)素和強力霉素）的抗性相對于野生株H1明顯增強，可能與外膜蛋白和脂多糖結構的改變有關；同時Δadh在生物被膜形成能力、溶血活性、對 EPC細胞的吸附能力以及對斑馬魚的致病性等方面均有明顯降低。
　　(3)相對于野生株H1，溫度敏感性血凝素缺失突變株Δtsh