糖尿病足感染病原菌的分布與取材及基于高通量測(cè)序技術(shù)的病原菌快速鑒定.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一章 糖尿病足創(chuàng)面感染病原菌分布及耐藥性15年變遷
　　目的：
　　探討DF創(chuàng)面感染病原菌分布特點(diǎn)及耐藥性變遷，指導(dǎo)臨床抗生素選擇，提高經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療的有效性。
　　對(duì)象及方法：
　　1.研究對(duì)象
　　收集2000年1月至2014年12月在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院住院治療的580例DFI患者的病例資料，回顧性分析其一般臨床資料、創(chuàng)面棉拭子微生物培養(yǎng)及藥敏結(jié)果。58

2、0例患者均符合WHO制定的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)及IDSA制定的DFI診斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　2.研究方法
　　(1)分組:580例DFI患者按照潰瘍PEDIS感染級(jí)別分為PEDIS2級(jí)組(96例)，PEDIS3級(jí)組（314例），PEDIS4級(jí)組（170例）;根據(jù)有無合并下肢動(dòng)脈缺血和周圍神經(jīng)病變，判斷潰瘍性質(zhì)為神經(jīng)性（339例）、缺血性（48例）、混合性潰瘍（193例）;季節(jié)采用候溫法劃分，根據(jù)廣東省月平均氣溫將季節(jié)劃分為春季（2～3月）

3、、夏季（4～10月）、秋季（11～1月）3個(gè)季節(jié)。比較上述各組病原菌分布特點(diǎn)。并根據(jù)耐藥性變化趨勢(shì)將資料按年份分為2組:2000～2010年、2011～2014年，分析15年來DFI病原菌對(duì)不同抗生素的耐藥性變遷情況。
　　(2)統(tǒng)計(jì)分析:采用SPSS19.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用Kolmogorov-Smimov test檢驗(yàn)是否為正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（第一四

4、分位數(shù)，第三四分位數(shù)）表示。計(jì)數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示，多組間比較采用卡方檢驗(yàn)。利用Logistic回歸分析DFI病原菌分布的影響因素。取P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.Logistic回歸分析結(jié)果提示DF潰瘍PEDIS感染級(jí)別(P＜0.001)及季節(jié)（P＜0.01）共同影響DFI病原菌類型。潰瘍性質(zhì)對(duì)DFI病原菌分布的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2.PEDIS2級(jí)的DFI潰瘍?cè)诟骷竟?jié)均

5、以G+菌感染為主;PEDIS4級(jí)的DFI潰瘍?cè)诟骷竟?jié)均以G-菌感染占優(yōu)勢(shì);而PEDIS3級(jí)者在春秋季以G+菌感染為主(55.3％)，夏季以G-菌感染為主(53.3％)(P＜0.05)。各個(gè)季節(jié)DFI創(chuàng)面的混合感染率均隨著PEDIS級(jí)別的增加而上升（P＜0.01）。
　　3.G+菌以葡萄球菌屬為主(44.7％)，對(duì)青霉素、氨芐西林完全耐藥，對(duì)萬古霉素、利奈唑胺100％敏感，15年來對(duì)阿莫西林/克拉維酸鉀的耐藥率由15.0％上升至48

6、.1％(P＜0.05);G-菌以腸桿菌科最常見(61.3％)，對(duì)氨芐西林耐藥率最高(91.3％)，對(duì)美羅培南最敏感(99.5％)，15年來對(duì)頭孢噻肟的耐藥率由29.2％增長(zhǎng)至43.7％(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、對(duì)DFI患者經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療時(shí)可綜合考慮潰瘍PEDIS級(jí)別與季節(jié)因素對(duì)感染病原菌類型的影響，并結(jié)合不同類型病原菌對(duì)抗生素的敏感性特點(diǎn)有針對(duì)性地選擇抗生素。
　　2、15年來我院DFI病原菌隨著時(shí)間變

7、遷對(duì)多種抗生素的耐藥性較早年有升高趨勢(shì)，其中β-內(nèi)酰胺類、頭孢菌素類尤甚。根據(jù)傷口特征合理有針對(duì)性地使用抗菌藥物，減少抗生素的濫用，對(duì)防止、延緩病原菌的耐藥性增長(zhǎng)，提高抗感染治療的有效性有重大意義。
　　第二章 糖尿病足感染創(chuàng)面拭子及深部組織微生物培養(yǎng)結(jié)果的一致性研究
　　目的：
　　在不同感染程度DFI創(chuàng)面中比較棉拭子及深部組織標(biāo)本微生物培養(yǎng)結(jié)果的一致性，評(píng)價(jià)創(chuàng)面棉拭子培養(yǎng)對(duì)DFI病原學(xué)診斷的有效性。
　　對(duì)象

8、及方法：
　　1.研究對(duì)象
　　本研究連續(xù)納入了2014年10月至2015年7月在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院住院治療的56例DFI患者。56例患者均符合WHO制定的DM診斷標(biāo)準(zhǔn)及IDSA制定的DFI診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并取得了所有納入患者的知情同意書。
　　2.研究方法
　　(1)分組:按照創(chuàng)面PEDIS感染級(jí)別分為3組:2級(jí)（10例）、3級(jí)(29例)、4級(jí)(17例)。
　　(2) DFI創(chuàng)面

9、棉拭子擦拭取樣:采用Levine棉拭子擦拭法。
　　(3) DFI創(chuàng)面深部組織取樣:采用組織鉆取法。
　　(4)微生物培養(yǎng):參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行。
　　結(jié)果：
　　1.DFI創(chuàng)面棉拭子標(biāo)本及深部組織標(biāo)本均培養(yǎng)出81株病原菌（平均每個(gè)標(biāo)本1.4株）。在不同PEDIS級(jí)別組中，2種不同取樣方法對(duì)于單一感染或混合感染的診斷均無顯著差異(P＞0.05)。
　　2.在PEDIS2級(jí)的DFI創(chuàng)面中，80.0

10、％的棉拭子標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果與對(duì)應(yīng)深部組織培養(yǎng)出的病原菌完全一致，而在PEDIS3級(jí)和4級(jí)的DFI創(chuàng)面，該比例顯著下降至31.0％及29.4％(P＜0.05)。
　　3.以深部組織培養(yǎng)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)棉拭子培養(yǎng)對(duì)DFI微生物學(xué)診斷的價(jià)值得出，棉拭子培養(yǎng)對(duì)于所有G+菌種類鑒定的敏感性均大于60％，特異性均大于80％。而在G-菌種類鑒定中，棉拭子微生物培養(yǎng)對(duì)于某些常見感染病原菌（如大腸埃希氏菌、摩根氏菌、枸櫞酸桿菌）鑒定的敏感性很低(3

11、3.3％)，另外有一些在深部組織標(biāo)本中培養(yǎng)陽性的G-菌（沙雷氏菌、不動(dòng)桿菌、皮氏拉斯通氏菌、抗壞血酸克魯依弗氏菌）均未在對(duì)應(yīng)的棉拭子標(biāo)本中分離出來。
　　結(jié)論：
　　1.創(chuàng)面棉拭子標(biāo)本微生物培養(yǎng)鑒定對(duì)于指導(dǎo)PEDIS2級(jí)DFI患者的抗感染治療方案，具有較高的可靠性。
　　2.對(duì)于PEDIS感染級(jí)別≥3級(jí)的DFI患者而言，創(chuàng)面棉拭子標(biāo)本對(duì)病原菌鑒定的可靠性顯著下降，尤其是易遺漏深部組織感染G-菌的診斷。因此，進(jìn)行創(chuàng)面深部

12、組織培養(yǎng)對(duì)于該類患者的DFI病原學(xué)診斷有必要性。
　　第三章 基于高通量測(cè)序技術(shù)的糖尿病足感染病原菌快速鑒定及皮膚菌群多樣性研究
　　目的：
　　驗(yàn)證基于PGM平臺(tái)的16S rRNA基因高通量測(cè)序技術(shù)在DFI病原菌快速鑒定中的可行性。并利用該技術(shù)比較DFI創(chuàng)面棉拭子標(biāo)本及深部組織標(biāo)本的微生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)，分析皮膚表面與DFI創(chuàng)面菌群結(jié)構(gòu)的差異性，探討創(chuàng)面中占主導(dǎo)作用的致病菌，推測(cè)皮膚微生態(tài)中可能的益生菌。
　

13、　對(duì)象及方法：
　　1.研究對(duì)象
　　納入2015年1月至2015年7月在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院住院治療的10例DFI患者。10例患者均符合WHO制定的DM診斷標(biāo)準(zhǔn)及IDSA制定的DFI診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并取得了所有納入患者的知情同意書。
　　2.研究方法
　　(1)標(biāo)本取材方法:DFI創(chuàng)面拭子擦拭取樣采用Levine棉拭子擦拭法(S組，編號(hào)為SI、S2...S9、S10）;DFI創(chuàng)面深部組織

14、取樣采用組織鉆取法（T組，編號(hào)為T1、T2...T9、T10）;皮膚表面微生物取樣采用無菌棉拭子擦拭法（C組，編號(hào)為C1、C2...C9、C10）。
　　(2)傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng):參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行。
　　(3)基因組DNA的提取與檢測(cè):采用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行基因組DNA提取。
　　結(jié)果：
　　1.通過16SrRNA基因高通量測(cè)序檢測(cè)到的菌屬種類（平均每個(gè)樣本66.

15、1種）顯著多于傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)到的菌屬種類（平均每個(gè)樣本1.5種）(P＜0.001)，且測(cè)序結(jié)果分析得出的菌群中均包含了傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)鑒定得出的病原菌。然而，80％傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果與測(cè)序診斷的優(yōu)勢(shì)菌群（豐度最高）不一致。
　　2.基于測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Alpha多樣性分析，結(jié)果顯示: C組OTU數(shù)量、菌屬數(shù)量及香農(nóng)指數(shù)均顯著高于T組及S組(P＜0.001)，而S組與T組之間的OTU數(shù)量、菌屬數(shù)量及香農(nóng)指數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。<

16、br>　　3.基于測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Beta多樣性分析，Venn圖提示，C組與T組之間、C組與S組之間、S組與T組之間重疊的菌種序列數(shù)分別僅占11.4％、11.0％、31.0％。主成分分析顯示代表C組樣本的點(diǎn)與代表S組、T組的點(diǎn)能顯著分開。部分代表S組樣本的點(diǎn)與對(duì)應(yīng)T組樣本的距離很近（如S1和T1），而另一部分卻明顯的分離開（如S3和T3）。
　　結(jié)論：
　　1.基于PGM測(cè)序平臺(tái)的16S rRNA基因高通量測(cè)序技術(shù)可能作為臨床D