養(yǎng)殖魚類病原菌檢測(cè)芯片技術(shù)的建立.pdf

1、水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類細(xì)菌性疾病頻繁爆發(fā)，危害極大，只有及時(shí)準(zhǔn)確的診斷出病原才能進(jìn)行有效的治療，保證魚類的健康養(yǎng)殖和可持續(xù)發(fā)展，因此，建立一種平行快速診斷方法至關(guān)重要。免疫芯片技術(shù)是一種新興的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，具有微量化、特異性強(qiáng)、敏感性高、樣品處理簡(jiǎn)單、高通量平行分析等優(yōu)點(diǎn)，在人類疾病的病原檢測(cè)上已顯示出廣闊的應(yīng)用前景，但在魚類疾病病原檢測(cè)方面的應(yīng)用卻鮮有報(bào)道。本文以瓊脂糖修飾基片為載體，建立了兩套微陣列芯片檢測(cè)系統(tǒng)，包括檢測(cè)魚類病原菌的抗體微陣

2、列和檢測(cè)魚類病原菌抗體的抗原微陣列。
　　 選取海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)、熒光假單胞菌(Psedomonas fluorescens)及海分支桿菌(Mycobacterium marinum)等6種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類病原菌，確認(rèn)其致病性后，制備全

3、菌兔抗血清；提取其中4種革蘭氏陰性菌的外膜蛋白，切取特異性條帶，制備特異蛋白條帶的兔抗血清。采用ELISA、Western-blot及Dot-blot分析了6種病原菌與各兔抗血清之間的免疫反應(yīng)，構(gòu)建了檢測(cè)6種病原菌的抗體微陣列，確定了芯片上抗體的最佳固定濃度、細(xì)菌孵育時(shí)間、標(biāo)記抗體稀釋倍數(shù)，對(duì)各株細(xì)菌進(jìn)行了檢測(cè)，并確定了其檢測(cè)限。另外，優(yōu)選各病原菌的特異性抗原，制備了檢測(cè)病原菌抗體的抗原微陣列。本文還將所制備的抗體芯片與抗原芯片應(yīng)用于人

4、工感染牙鲆(Paralichthys olivaceus)和天然患病紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)病原的診斷。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 (1)通過(guò)致病性實(shí)驗(yàn)確認(rèn)上述6株菌的半數(shù)致死量分別為7.94×105、6.31×105、1×106、7.94×105、1.26×107、2.51×107cfu/尾，具有較強(qiáng)的毒力。
　　 (2)提取遲緩愛德華氏菌、鰻弧菌、殺鮭氣單胞菌、熒光假單胞菌4種革蘭氏陰性菌的外膜

5、蛋白(OMP)，切取35kD遲緩愛德華氏菌OMP、38kD鰻弧菌OMP、42kD殺鮭氣單胞菌OMP、34kD和22kD熒光假單胞菌OMP，分別制備6種菌全菌及切取的OMP的兔抗血清，ELISA、Western-blot及Dot-blot分析6種魚類病原菌與兔抗血清之間的免疫反應(yīng)結(jié)果顯示，34kD熒光假單胞菌OMP兔抗血清與各菌有強(qiáng)烈交叉反應(yīng)，無(wú)法用于檢測(cè)；其余各抗血清與相應(yīng)的抗原菌株的反應(yīng)是最強(qiáng)烈的，可用于免疫診斷芯片的制備與抗原菌的檢

6、測(cè)。
　　 (3)將純化的各兔抗血清的濃度稀釋為3、2.5、2、1.5、1、0.5 mg/mL，每個(gè)濃度為一矩陣，每個(gè)矩陣內(nèi)以3×3形式點(diǎn)樣于芯片載體，結(jié)果顯示，芯片上捕獲抗體的最佳固定濃度為：海分支桿菌抗體為1.5 mg/mL，其余5株菌抗體為0.5mg/mL。將捕獲抗體在片基上以4×4形式點(diǎn)樣，細(xì)菌孵育時(shí)間設(shè)為0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h，結(jié)果顯示，海豚鏈球菌、鰻弧菌、熒光假單胞菌孵育1h，而遲緩愛德華

7、氏菌、殺鮭氣單胞菌和海分支桿菌孵育1.5 h時(shí)取得的信號(hào)值最高。檢測(cè)抗體稀釋倍數(shù)確定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)標(biāo)記抗海豚鏈球菌血清可稀釋2000倍使用，標(biāo)記抗遲緩愛德華氏菌血清可稀釋6000倍使用，而標(biāo)記鰻弧菌、殺鮭氣單胞菌、熒光假單胞菌、海分支桿菌抗血清可稀釋4000倍使用。
　　 (4)構(gòu)建了檢測(cè)6種病原菌的抗體芯片，第一種抗體芯片片基上固定的是各全菌抗血清，第二種抗體芯片片基上固定的抗體為海豚鏈球菌、海分支桿菌全菌抗血清及其余4種菌的OMP

8、抗血清。利用抗體芯片對(duì)6種病原菌進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，使用酶標(biāo)單一抗體對(duì)單株菌液進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)捕獲抗體為全菌抗血清時(shí)，可檢測(cè)出1010-103cfu/mL的海豚鏈球菌、鰻弧菌，1010-104cfu/mL的遲緩愛德華氏菌，109-103cfu/mL的殺鮭氣單胞菌、熒光假單胞菌、海分支桿菌；當(dāng)捕獲抗體為OMP抗血清時(shí)，可檢出1010-103cfu/mL的海豚鏈球菌，1010-104fu/mL的遲緩愛德華氏菌，109-105 fu/mL的鰻弧菌、熒光

9、假單胞菌，109-103 cfu/mL的殺鮭氣單胞菌、海分支桿菌。單一檢測(cè)抗體對(duì)混合菌液進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示，濃度為1010-106cfu/mL混合菌液內(nèi)的海豚鏈球菌、海分支桿菌，109-105fu/mL混合菌液內(nèi)的遲緩愛德華氏菌、鰻弧菌，109-106cfu/mL的殺鮭氣單胞菌，1010-107cfu/mL混合菌液內(nèi)的熒光假單胞菌可被檢出。酶標(biāo)混合抗體對(duì)單株菌液的檢測(cè)結(jié)果顯示，1010-104 cfu/mL的海豚鏈球菌、遲緩愛德華氏菌、

10、殺鮭氣單胞菌，1010-103 cfu/mL的鰻弧菌、熒光假單胞菌、海分支桿菌可被檢出。
　　 (5)分別提取了海豚鏈球菌的類M蛋白、莢膜多糖、胞外產(chǎn)物，4種革蘭氏陰性菌的外膜蛋白、胞外產(chǎn)物、鞭毛蛋白和海分支桿菌的細(xì)胞壁蛋白，并制備6種菌的全菌破碎液，分別稀釋為1 mg/mL，點(diǎn)在芯片載體上，根據(jù)是否與對(duì)應(yīng)菌免疫牙鲆產(chǎn)生的抗血清反應(yīng)篩選各菌的特異性抗原。用各菌特異性抗原構(gòu)建抗原芯片，檢測(cè)抗體水平變化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加強(qiáng)免疫后，檢測(cè)點(diǎn)顏

11、色逐漸加深，海豚鏈球菌免疫的牙鲆抗體在第四周時(shí)紫紅色最深，說(shuō)明抗體水平達(dá)到峰值，其他菌株免疫的牙鲆則在第五周時(shí)抗體水平達(dá)到峰值，之后緩慢下降。將6種菌的所有抗原點(diǎn)到同一矩陣內(nèi)，構(gòu)建病原菌抗原芯片，通過(guò)檢測(cè)病原菌抗體以診斷病原，結(jié)果顯示，檢測(cè)注射無(wú)菌PBS的牙鲆抗血清時(shí)，除陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)顯深紫紅色外，無(wú)其他任何反應(yīng)；當(dāng)檢測(cè)樣品為海豚鏈球菌免疫牙鲆后的抗血清時(shí)，抗血清可與該菌所有抗原點(diǎn)反應(yīng)，而與其他菌的抗原點(diǎn)或無(wú)反應(yīng)，或顯色反應(yīng)較淺，由此判定牙

12、鲆已感染海豚鏈球菌；對(duì)其他5種菌免疫牙鲆后的抗血清進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果也是如此，說(shuō)明構(gòu)建的抗原芯片可以進(jìn)行準(zhǔn)確診斷。
　　 (6)將構(gòu)建的抗體芯片應(yīng)用于人工感染一種或多種病原菌的牙鲆的病原診斷，結(jié)果顯示，從單獨(dú)注射海豚鏈球菌液或遲緩愛德華氏菌液的牙鲆組織里可準(zhǔn)確檢測(cè)出兩種菌；注射鰻弧菌、熒光假單胞菌和海分支桿菌混合液的牙鲆組織勻漿液，在使用單一檢測(cè)抗體時(shí)，可檢出相應(yīng)的病原菌，使用混合檢測(cè)抗體時(shí)可同時(shí)準(zhǔn)確檢出3株菌；而抗體芯片對(duì)自然發(fā)病

13、紅鰭東方鲀進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)在其膽汁中可檢測(cè)到海豚鏈球菌、鰻弧菌、殺鮭氣單胞菌與熒光假單胞菌。利用抗原芯片對(duì)人工感染后的牙鲆血清進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)芯片上海豚鏈球菌或遲緩愛德華氏菌的各抗原均被染色，判為海豚鏈球菌或遲緩愛德華氏菌檢測(cè)陽(yáng)性；對(duì)患病紅鰭東方純及健康牙鲆血清的檢測(cè)，除陽(yáng)性對(duì)照外，未發(fā)現(xiàn)有其他點(diǎn)顯色。ELISA對(duì)相同樣品的檢測(cè)得到了同樣的結(jié)果。
　　 病原菌檢測(cè)免疫芯片是對(duì)傳統(tǒng)免疫學(xué)檢測(cè)手段的發(fā)展，本文構(gòu)建了檢測(cè)6種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類細(xì)