6種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類常見弧菌抗原芯片檢測(cè)技術(shù)的建立.pdf

1、近年來(lái)我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)飛速發(fā)展,養(yǎng)殖的水產(chǎn)動(dòng)物種類日益增多,隨著集約化養(yǎng)殖形式和養(yǎng)殖密度不斷擴(kuò)大,病原、宿主與環(huán)境之間的相互作用導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物的抵抗力降低,發(fā)病日趨頻繁。細(xì)菌性疾病是水產(chǎn)動(dòng)物最常見的一類疾病,是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類的主要病害,其中以弧菌病流行最為廣泛?；【鷱V泛分布于海洋環(huán)境中,可以感染多種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類并造成嚴(yán)重死亡,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　抗原芯片的基本原理是將抗原固定在芯片載體上制備成檢測(cè)芯片,檢測(cè)血清中相

2、對(duì)應(yīng)的抗體,近些年己被廣泛應(yīng)用于臨床學(xué)和流行病學(xué)。抗原芯片因其具有高靈敏性、高特異性、高通量及多樣品或多指標(biāo)平行分析的優(yōu)點(diǎn),在病原檢測(cè)方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景。但目前將抗原芯片應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道較少,因此本文將抗原芯片技術(shù)與水產(chǎn)動(dòng)物免疫學(xué)原理相結(jié)合,選取魚腸道弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌、哈維氏弧菌6種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類常見弧菌為研究對(duì)象,構(gòu)建水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類常見弧菌的抗原芯片,并進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用,證明構(gòu)建的抗原芯

3、片可以應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類6種常見弧菌性疾病的準(zhǔn)確診斷。具體結(jié)果如下:
　　(1)在確認(rèn)各弧菌菌株致病性的基礎(chǔ)上,提取各弧菌的外膜蛋白、胞外產(chǎn)物、鞭毛蛋白等抗原組分以及全菌超聲波破碎液,考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定各抗原組分濃度,以HIRP標(biāo)記牙鲆免疫球蛋白單克隆抗體,進(jìn)行了病原性確認(rèn)。結(jié)果顯示,提取的各弧菌抗原組分均可與對(duì)應(yīng)的牙鲆抗血清發(fā)生反應(yīng),說(shuō)明其病原性良好,可以用來(lái)構(gòu)建抗原芯片。
　　(2)采用滅活全菌注射健康牙鲆,獲取各弧菌的牙

4、鲆抗血清;ELISA檢測(cè)牙鲆抗血清的效價(jià)變化并分析各抗原組分與牙鲆抗血清的交叉反應(yīng)情況。結(jié)果顯示,牙鲆的抗體水平不斷上升,在第4、5、6周達(dá)到最高,由此選取4-6周的抗血清用于后續(xù)抗原芯片的檢測(cè)。各弧菌的牙鲆抗血清均與對(duì)應(yīng)弧菌的反應(yīng)程度最強(qiáng)烈,與其他種類的弧菌存在程度不等的交叉反應(yīng),而胞外產(chǎn)物和鞭毛蛋白的交叉反應(yīng)很小,確認(rèn)了抗原芯片構(gòu)建的可行性。
　　(3)采用前期優(yōu)化的芯片載體、點(diǎn)樣緩沖液、固定時(shí)間、封閉時(shí)間、抗體孵育時(shí)間及清洗

5、緩沖液;將同一弧菌的多種抗原組分點(diǎn)樣于芯片載體組成一個(gè)矩陣,構(gòu)建6種弧菌抗原芯片,并對(duì)牙鲆抗血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,牙鲆抗血清與對(duì)應(yīng)弧菌的各矩陣點(diǎn)全部顯色,與其他弧菌的矩陣點(diǎn)無(wú)顯色反應(yīng)或部分顯色,說(shuō)明構(gòu)建的抗原芯片可以用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物常見的6種致病性弧菌的準(zhǔn)確檢測(cè)。
　　(4)將制備的抗原芯片應(yīng)用子人工感染牙鲆和自然發(fā)病大菱鲆的疾病檢測(cè)。結(jié)果顯示,人工感染的牙鲆抗血清與抗原芯片上鰻弧菌的各抗原矩陣點(diǎn)反應(yīng)完全,自然發(fā)病的大菱鲆抗血清