熒光標記噬菌體技術(shù)檢測食源性腸道病原菌方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、沙門氏菌、大腸桿菌和志賀氏菌是主要的食源性病原菌，在每年的食物中毒報告中占80％以上，常引發(fā)敗血癥、胃腸炎以及其它局部組織炎癥，甚至出現(xiàn)水腫、痢疾性腹瀉和神經(jīng)癥狀，給人民健康和國家的經(jīng)濟帶來極大危害和損失。目前其檢測主要以傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、生化檢測和分子生物學(xué)為主，但這些方法都存在一定的弊端，已不能滿足實際檢測的需要。熒光標記噬菌體技術(shù)是根據(jù)噬菌體特異性侵染宿主菌的原理，結(jié)合熒光染料技術(shù)、光學(xué)顯微鏡技術(shù)放大信號，提高靈敏度和縮短檢測時間，

2、以實現(xiàn)病原菌的快速、直觀、準確的檢測。檢測周期短，能區(qū)分死活細菌，準確性好，選擇不同標記的配套噬菌體可實現(xiàn)兩種以上病原菌同步檢測的目的，為同步檢測食品中的三種病原菌提供了必要的條件。
　　 本文建立了用單一的熒光標記沙門氏菌屬噬菌體檢測食源性沙門氏菌的方法，以及雙重?zé)晒鈽擞泴俜N配套噬菌體同步檢測沙門氏菌、大腸桿菌和志賀氏菌及O157:H7、福氏和痢疾志賀氏菌的方法，并用該方法對華東地區(qū)海產(chǎn)品中這幾種細菌的污染情況進行調(diào)查。

3、>　　 試驗Ⅰ從單一的噬菌體標記技術(shù)入手，測定熒光標記噬菌體的特異性、敏感性，建立了基于SYBR gold染料標記的O-I噬菌體檢測食品中沙門氏菌屬細菌的方法。通過用標記噬菌體對五種腸桿菌科細菌進行侵染，結(jié)果表明O-I噬菌體的屬特異性很高，SYBR gold染料標記不會影響其特性；檢測敏感度為8.5 CFU.100μL-1。實際樣品檢測與生化鑒定的符合率達91.7％。整個檢測周期可于8h內(nèi)完成。該方法可快速準確檢測海產(chǎn)品中的沙門氏菌。

4、
　　 試驗Ⅱ志賀氏菌屬噬菌體Sh用SYBR gold熒光標記，福氏和痢疾志賀氏菌的種特異性噬菌體D2和2用DAPI標記，檢測其敏感性后對同一菌液分別用標記的Sh和D2、Sh和2侵染，不同波長鏡檢，實現(xiàn)志賀氏菌屬細菌檢測的同時得知福氏和痢疾志賀氏菌的陰陽性。建立了雙重?zé)晒馊玖蠘擞浀氖删w檢測同一病原菌的方法，該方法對志賀氏菌菌液的檢測敏感度為8.0 CFU.100μL-1，實際樣品檢測結(jié)果與生化鑒定的符合率達95.7％，福氏和痢

5、疾志賀氏菌與生化鑒定結(jié)果符合率達均為100％。該方法可用于志賀氏菌的快速檢測。
　　 試驗Ⅲ沙門氏菌、大腸桿菌和志賀氏菌的屬噬菌體O-I、E4和Sh用SYBR gold熒光標記，O157:H7、福氏和痢疾志賀氏菌的種特異性噬菌體LG1、D2和2用DAPI核酸染料標記，所有噬菌體配套使用，摸索反應(yīng)裂解模式，實現(xiàn)三種細菌的同步快速檢測，同時得知O157:H7、福氏和痢疾志賀氏菌的陰陽性。試驗中各標記噬菌體的檢測敏感度均低于為10 C

6、FU.100μL-1。實際樣品檢測與生化鑒定結(jié)果相當，O157:H7、福氏和痢疾志賀氏菌與生化鑒定結(jié)果符合率達均為100％。建立的方法可用于食源性沙門氏菌、大腸桿菌和志賀氏菌的同步、快速而準確的檢測，并得知部分細菌的陰陽性。
　　 試驗Ⅳ對華東地區(qū)海產(chǎn)品中沙門氏菌、大腸桿菌和志賀氏菌的污染情況進行了調(diào)查發(fā)現(xiàn)：沙門氏菌檢出率為16.6％，大腸桿菌檢出率為9.6％，志賀氏菌檢出率為9％，其中O157:H7、福氏志賀氏菌和痢疾志賀氏菌