四種豬病原菌PCR診斷方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）是豬傳染性胸膜肺炎的主要病原菌。豬感染APP后會(huì)導(dǎo)致急性纖維素性肺炎、肺出血性壞死乃至死亡，或者演變成慢性感染，雖無明顯的臨床癥狀但生長緩慢乃至成為僵豬。發(fā)病后幸存下來攜帶病原菌的豬，可能會(huì)成為再次爆發(fā)此病的傳染源。近年來，豬傳染胸膜肺炎放線桿菌繼發(fā)感染以及與其它病原菌混合感染的情況越來越嚴(yán)重，造成臨床上癥狀愈加復(fù)雜而難以區(qū)分。迄今為止，

2、根據(jù)莢膜多糖，可將APP分為15種血清型。根據(jù)培養(yǎng)過程中是否需要加NAD，可將APP分為生物Ⅰ型和生物Ⅱ型，我國流行的主要是生物Ⅰ型。由于APP血清型眾多，現(xiàn)有的商品化疫苗沒有涵蓋所有血清型，加上制備型特異性血清過程復(fù)雜且耗時(shí)長，導(dǎo)致對(duì)該病的診斷和預(yù)防帶來了很大的困難。因此，APP的鑒定及分型，以及進(jìn)一步根據(jù)病原采取對(duì)應(yīng)的疫苗防疫和藥物治療措施，對(duì)該病的綜合防控具有重要的意義。
　　本研究利用APP生物Ⅰ型標(biāo)準(zhǔn)菌株制備了13種標(biāo)準(zhǔn)

3、陽性血清，經(jīng)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(GDT)測(cè)定后，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清5型的效價(jià)是1∶8;標(biāo)準(zhǔn)陽性血清2型、4型、9型和15型的效價(jià)是1∶16;標(biāo)準(zhǔn)陽性血清1型、3型、6型、7型、8型、10型、11型和12型的效價(jià)是1∶32。
　　近年來，復(fù)合PCR方法因快速、簡便的特點(diǎn)而發(fā)展迅速得到廣泛的應(yīng)用。根據(jù)APP的四種外毒素apxⅠ、apxⅡ、apxⅢ和apxⅣ設(shè)計(jì)了5對(duì)特異性引物，建立了復(fù)合PCR分子分型方法研究，通過一步復(fù)合PCR方法就可以區(qū)分出A

4、PP血清型1～13中的7種（1型、3型、4型、5型、8型、10型和12型）。
　　豬呼吸道疾病是導(dǎo)致保育豬和生長豬以及育肥豬死亡的主要原因。豬嗜血桿菌、豬鏈球菌、豬多殺巴氏桿菌和豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌是引起呼吸道綜合征(PRDC)的主要病原菌。本研究針對(duì)副豬嗜血桿菌的16S rRNA基因、豬鏈球菌的gdh基因、豬多殺巴氏桿菌的kmt基因和豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的apxⅣ基因設(shè)計(jì)出四對(duì)特異性引物，分別擴(kuò)增出了長度為821bp、6

5、89 bp、457 bp、319 bp的特異性片段。在建立了APP單一PCR方法基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)影響PCR的幾個(gè)主要因素(rTaq酶、Mg2+濃度、dNTP濃度和引物濃度)進(jìn)行優(yōu)化，建立了復(fù)合PCR檢測(cè)方法。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌、豬多殺巴氏桿菌和豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌復(fù)合PCR只能擴(kuò)增出四種特異性的目的條帶，其它結(jié)果為陰性;敏感性試驗(yàn)中，最低檢測(cè)量分別是副豬嗜血桿菌為112.5pg/μL，豬鏈球菌為11.7pg/