血流感染的早期診斷與病原菌識別

1、,血流感染的早期診斷與病原菌識別,,,,,,,,,,,,,,01,02,03,04,血流感染的定義、診斷及流行病學(xué),早期診斷與病原菌識別的方法-血培養(yǎng)相關(guān)問題,早期診斷與病原菌識別-感染標(biāo)志物相關(guān)問題,早期診斷與病原菌識別-分子生物學(xué)檢測相關(guān)問題,目 錄,血流感染定義（BSI）,敗血癥（septicemia）：病原菌及其毒素侵入血流所引起的臨床綜合征，是一種嚴(yán)重的全身感染性疾病，病原菌主要是細(xì)菌，也可為真菌、分枝桿菌等。菌血

2、癥（bacteremia）：細(xì)菌在血流中短暫出現(xiàn)的現(xiàn)象，一般無明顯毒血癥狀，在國外文獻(xiàn)中常與敗血癥通用。血流感染（bloodstream infection, BSI）：敗血癥和菌血癥目前統(tǒng)稱為血流感染。,血流感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)（2001年衛(wèi)生部頒布）,血流感染診斷標(biāo)準(zhǔn)（1996美國疾病控制與預(yù)防中心）,血培養(yǎng) 1 次或 1 次以上陽性 , 陽性病原體與其他感染部位無關(guān)。 患者至少有以下 1 項癥狀或體征 : 發(fā)熱 (38 ℃ )、

3、寒戰(zhàn)或低血壓 , 同時至少滿足以下任意 1 項 : ①若血培養(yǎng)為常見的皮膚寄植菌需有不同時間 2 次或 2 次以上的血培養(yǎng)陽性。 ②若血培養(yǎng)為上述常見皮膚寄植菌 , 血培養(yǎng)僅 1 次陽性則需同時有靜脈導(dǎo)管培養(yǎng)為陽性的同一病原菌且已開始正確的抗微生物治療。③血抗原測定陽性 , 且癥狀、 體征、實驗室結(jié)果不能用其他部位的感染來解釋,血流感染流行病學(xué)資料,全球：1800萬病例美國：確診病例130萬歐洲和日本：確診病例19

4、0萬每年治療費用：167億美金－美國67億美金－歐洲,導(dǎo)致死亡病種排名第十位每年導(dǎo)致大約40萬人死亡敗血癥在10年間增加了139％非心內(nèi)ICU病區(qū)最常見的死亡病因在130萬病例中，有78萬例發(fā)生在ICU病區(qū),Crit Care Med 2001; 29: 1303-10,國內(nèi)血流感染的病死率,結(jié)論：普通住院患者BSI的病死率為20.7%，燒傷、血液病腫瘤以及ICU患者病死率更高，而新生兒病房、肝病及糖尿病患者則相對較低。醫(yī)

5、院BSI 病死率為26.8%，明顯高于社區(qū)BSI的病死率。近幾十年來，BSI住院病死率呈下降趨勢。,,,,,病死率,臨床表現(xiàn),血培養(yǎng),治療問題,血流感染病情兇險，死亡率高達(dá)26-41%,陽性率低，培養(yǎng)結(jié)果所需時間長（2-5天）,臨床表現(xiàn)缺乏特異性，診斷困難,不恰當(dāng)?shù)慕?jīng)驗性治療易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥及醫(yī)療資源浪費,血流感染早期診斷治療存在的問題,早期診斷與病原菌識別的主要方法,,,,,,,,快速檢測方法，包括原位分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)、基因芯片、

6、質(zhì)譜技術(shù)等,針對免疫和炎癥反應(yīng)的指標(biāo);包括TNF-a、PCT、IL-6、CRP、乳酸及內(nèi)毒素等，特異性差,血培養(yǎng),分子生物學(xué)檢測,感染標(biāo)志物檢測,血流感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但陽性率低，檢測周期長（3-7天）,血流感染的血培養(yǎng)方法,臨床細(xì)菌/真菌檢測常用的方法,,,,生化表型,全自動微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng),血培養(yǎng)研究,對2004年1月-2005年12月入住Robert Wood Johnson大學(xué)附屬醫(yī)院及Duke大學(xué)醫(yī)療中心且血培養(yǎng)陽性的

7、成人患者進(jìn)行回顧性分析，患者在24h內(nèi)均接受 ≥3次血培養(yǎng)研究旨在評估血培養(yǎng)次數(shù)與陽性率的相關(guān)性,Lee A et al. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY.2007;45(11):3546–3548,單一病原體感染：多次血培養(yǎng)可提高陽性率,24小時血培養(yǎng)次數(shù)≥3次或4次的患者，前兩次血培養(yǎng)的陽性率99%,陽性率,Lee A et al. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY

8、.2007;45(11):3546–3548,混合感染：多次血培養(yǎng)可提高陽性率,研究期間，共發(fā)生58例由多種病原體導(dǎo)致的血流感染，該類患者前三次血培養(yǎng)的陽性率為100%,陽性率,N=58例,Lee A et al. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY.2007;45(11):3546–3548,病原體血培養(yǎng)的陽性率與采血體積相關(guān),導(dǎo)致血流感染的G-菌、G+菌、厭氧菌及真菌，其血培養(yǎng)的陽性率均與采血體積相關(guān),

9、陽性率,標(biāo)準(zhǔn)體積：采血量為7-10ml,平均8.7ml; 低體積：采血量<3.5ml;平均2.7ml,Mermel LA et al.Ann Intern Med. 1993;119:270-272.,CLSI指南對血培養(yǎng)次數(shù)及采血體積的推薦,,CLSI指南推薦：菌血癥的患者行4次血培養(yǎng)，且每次采血量為10ml，可獲得90-95%的陽性檢出率當(dāng)血培養(yǎng)次數(shù)增加到6次時，陽性率可增加至95-99%,Towns ML et al.

10、J Microbiol Immunol Infect 2010;43(4):347–349,血培養(yǎng)的報陽時間價值,結(jié)論：結(jié)合血培養(yǎng)陽性報警時間結(jié)合臨床其他指標(biāo)，對于早期判斷檢出菌為病原菌或污染菌具有一定的參考價值。,感染標(biāo)志物的診斷價值,,,,,降鈣素原主要是在甲狀腺旁細(xì)胞內(nèi)分泌的無激素活性的降鈣素前肽物質(zhì)，發(fā)生全身感染及炎性反應(yīng)時，細(xì)菌毒素和炎性細(xì)胞因子的誘導(dǎo)刺激下，ＰＣＴ分泌迅速升高，但在病毒感染時水平很低，血清 ＰＣＴ水平高低反映

11、疾病嚴(yán)重狀態(tài)，是判斷預(yù)后的良好指標(biāo)。,細(xì)胞因子參與機體的抗炎、抗感染及免疫調(diào)節(jié)作用，尤其在抗感染及嚴(yán)重感染方面起著重要作用，細(xì)胞黏附分子（ＣＡＭ）參與機體免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)等一系列生理病理過程.包括IL-6、IL-8、TNF-a、VCAM-1等,革蘭陰性菌進(jìn)入血液釋放內(nèi)毒素可引起內(nèi)毒素血癥，CRP是重要的急性時相反應(yīng)蛋白之一，主要由IL-6分泌，血流感染時明顯增高，敏感性高，,降鈣素原PCT,細(xì)胞因子及黏附因子,內(nèi)毒素及CRP,（1-3

12、）β-Ｄ葡聚糖,普遍存在于各種真菌中，是真菌細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)之一，真菌感染時明顯增高，檢測敏感、快速。,降鈣素原診斷價值,選擇2011-2014年4家醫(yī)院的4279例感染患者，進(jìn)行降鈣素原、SIRS評分及乳酸水平監(jiān)測和血培養(yǎng)檢查，并對535例血培養(yǎng)陽性的血流感染患者進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)分析，評價降鈣素原對血流感染的診斷價值,降鈣素原診斷價值,,,血流感染標(biāo)本細(xì)菌的分布情況,血流感染時多因素分析,,降鈣素原診斷價值,結(jié)論：PCT為血流感染的獨立影

13、響因素，即使在血乳酸正?；騍IRS評分陰性時，PCT增高應(yīng)查找可能發(fā)生的血流感染,不同感染標(biāo)志物的診斷價值-1,結(jié)論：PCT、CRP及IL-6 聯(lián)合檢測較單項檢測診斷價值更高， 且能在1天內(nèi)報告檢測結(jié)果，有助于細(xì)菌性BSI的早期診斷和治療，可為臨床醫(yī)師提供快速、可靠的實驗室依據(jù),不同感染標(biāo)志物的診斷價值-2,回顧性分析重癥監(jiān)護病房(ICU)確診為膿毒癥且血培養(yǎng)陽性的132例患者的臨床資料，根據(jù)血培養(yǎng)結(jié)果將膿毒癥患者分為革蘭陰性(G-)桿

14、菌血流感染組(98例)和革蘭陽性(G+)球菌血流感染組(34例)，比較兩組患者6 h內(nèi)的炎癥因子，如白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞比例(N)、CRP、PCT、內(nèi)毒素水平等的差異及其之間的相關(guān)性；繪制各炎癥因子對血流感染所致膿毒癥診斷的受試者工作特征曲線(ROC曲線)，根據(jù)曲線下面積(AUC)來評價其對血流感染所致膿毒癥的診斷價值，根據(jù)最佳診斷臨界值評估各數(shù)值對血流感染診斷的敏感性和特異性,不同感染標(biāo)志物的診斷價值-2,結(jié)果顯示G-菌

15、BSI患者的血漿PCT、內(nèi)毒素及血清CRP水平均明顯高于G+菌BSI患者；ROC曲線分析顯示，血漿PCT診斷G-菌BSI患者的AUC為0.825，當(dāng)PCT>2.455微克/L,診斷G-菌BSI的敏感度為71.4%，特異度96.2%。在G+菌血流感染所致膿毒癥患者，PCT的AUC為0.619，最佳診斷臨界值>1.585微克/L,敏感度41.2％、特異度82．診斷細(xì)菌性BSI時，血漿PCT的敏感性和特異性較血清CRP、血漿

16、內(nèi)毒素明顯增高,結(jié)論：G-菌血流感染所致膿毒癥患者PCT、CRP、內(nèi)毒素水平高于G+菌血流感染者，三者聯(lián)合檢測有望成為早期判斷血流感染所致膿毒癥及其病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)。,分子生物學(xué)指標(biāo)監(jiān)測,聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,熒光原位雜交技術(shù),基因芯片技術(shù),質(zhì)譜技術(shù),一、熒光原位雜交技術(shù)（FISH）,核酸雜交技術(shù)核酸雜交是指具有一定互補序列的2條核酸單鏈在液相或固相體系中按堿基互補配對原則形成同源或異源雙鏈分子的過程。核酸雜交可在DNA與DNA、

17、RNA與RNA或RNA與DNA的2條條單鏈之間進(jìn)行。其中，熒光原位雜交技術(shù)（FISH）應(yīng)用于臨床實驗室鑒定工作已有10余年，其檢測的敏感性和特異性可達(dá)到96-100%,血培養(yǎng)陽性－PNA FISH核酸熒光原位雜交,血培養(yǎng)陽性肉湯　　 革蘭染色　　 PNA FISH,,,革蘭陰性菌：商品化試劑盒eco/kpn/paeEfa/其它腸球Sau/scnCal/cgl/其它念珠菌報道Salmonella spp.90min

18、 PNA FISH完成,,Appl Environ Microbiol. 2010 ;76:4476 J. Clin. Microbiol. 2013, 51(4):1301J Clin Microbiol. 2009; 47: 247,熒光原位雜交技術(shù)-細(xì)菌早期識別,新的熒光原位雜交技術(shù)對血培養(yǎng)陽性快速病原體識別,結(jié)果顯示：152例患者血培養(yǎng)陽性的個標(biāo)本中，F(xiàn)ISH鑒定細(xì)菌生長的陽性例標(biāo)本數(shù)145個。在病原菌鑒別中138例準(zhǔn)確

19、，7例錯誤，微生物識別準(zhǔn)確率95.2%,可信區(qū)間95%。在需氧菌和厭氧菌的鑒別沒有差異。對血培養(yǎng)陽性病原菌鑒別時間為30分鐘，上機時間僅需10分鐘。結(jié)論：熒光原位雜交技術(shù)對于血流感染的快速診斷和病原菌精確識別具有重要的臨床意義,熒光原位雜交技術(shù)-真菌早期識別,對照性研究通過對疑似侵襲性真菌感染患者血培養(yǎng)和腦脊液中病原體的檢測，以評價FISH技術(shù)的診斷價值。,熒光原位雜交技術(shù)-真菌早期識別,在112份腦脊液標(biāo)本中，F(xiàn)ISH檢測真菌的陽

20、性率稍高于傳統(tǒng)墨汁染色顯微鏡檢測值（48/46），且陽性結(jié)果敏感性和特異性均為100%。對血標(biāo)本中病原菌的鑒別能力傳統(tǒng)方法、PCR-RFLP及FISH沒有差異（14/30）血培養(yǎng)確定微生物生長后進(jìn)行病原菌識別的平均時間有明顯差異，傳統(tǒng)顯微鏡識別、PCR-RFLP及FISH分別為6天、12小時和5小時,,,,結(jié)論：熒光原位雜交技術(shù)在侵襲性真菌感染的病原菌識別方面具有重要價值,二、基因芯片技術(shù),基因芯片(gene chip)基因芯片也

21、稱DNA微陣列，可分固相基因芯片和液相基因芯片。基因芯片檢測基本原理是將已知的核酸片段固定在一定的固相支持物表面制成核酸探針，利用堿基互補原理，使其與待測DNA標(biāo)本進(jìn)行雜交反應(yīng)，從而獲得需要的生物學(xué)信息。液相基因芯片是近年來發(fā)展出的一種新的芯片技術(shù)，與固相芯片相比，液相芯片在反應(yīng)動力學(xué)、反應(yīng)速度、檢測敏感性、穩(wěn)定性以及自動化程度方面都有較大的優(yōu)越性商品化基因芯片血流感染病原體檢測均應(yīng)用于陽性血培養(yǎng)物（血培養(yǎng)陽性病原菌鑒定）,,結(jié)果：

22、標(biāo)本病原菌識別率為86%（1807/2017），敏感率為94.7%（95%CI），特異性為98.8%。而對MRSA的特異性為100%。病原菌檢測時間僅需18小時結(jié)論：基因芯片技術(shù)對細(xì)菌種類進(jìn)行最終鑒定具有較傳統(tǒng)血培養(yǎng)敏感性高、特異性強及時間更短的特點。有利于臨床膿毒癥快速診斷和早期治療。,基因芯片技術(shù)對血培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌種類準(zhǔn)確、快速鑒定的一項觀察性研究對英國和芬蘭兩個醫(yī)學(xué)中心3318例疑似膿毒癥患者的2107份血培養(yǎng)陽性標(biāo)本用

23、新型的PCR擴增和基因芯片技術(shù)檢測鑒定血標(biāo)本中病原菌，并與常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)方法對照,三、質(zhì)譜技術(shù),質(zhì)譜(mass spectrometry,MS)技術(shù)，尤其是基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜 (MALDI-TOF MS)，具有簡便、快速及特異地分析微生物大分子標(biāo)記物質(zhì)譜圖，從而實現(xiàn)臨床微生物檢驗中細(xì)菌、真菌及病毒在屬、種、株水平上的鑒定。 MS 在菌血癥、尿路感染、毒素檢測及耐藥監(jiān)測方面顯示出巨大的優(yōu)勢，有望成為臨床微生物實驗室感染性疾

24、病常用診斷方法,弗朗西斯·阿斯頓于1919年制成的第一臺質(zhì)譜分析儀，1922年諾貝爾化學(xué)獎,MALDI-TOF MS操作步驟,MALDI-TOF MS快速鑒定陽性血培養(yǎng),使用菌落、陽性血培養(yǎng)肉湯鑒定快速：20分鐘(從報警到鑒定出結(jié)果）MALDI-TOF MS(Bruker)+BACTEC(BD):正確鑒定：193/213陰性菌（包括厭氧菌）(90.61%)，284/319陽性菌(89.02%)80.9%復(fù)數(shù)菌正確鑒定出

25、一種，7株緩癥鏈球菌鑒定為spnMALDI-TOF MS(Bruker)+BacT/ALERT(bioMérieux):388個陽性瓶，種正確率91%（包括念珠、厭氧菌）15瓶復(fù)數(shù)菌：使用通用庫多鑒定出一種，革蘭染色后使用陰性或陽性庫分析，6瓶鑒定出第二種菌,Clin Microbiol Infect 2010; 16: 1631　J Clin Microbiol 2010; 48: 1542,MALDI-TOF MS,

26、VITEK MS(bioMérieux)以16s為金標(biāo)準(zhǔn)，980株臨床分離株，ID正確率腸桿菌科97.7%非發(fā)酵菌92%葡萄球菌屬94.3%鏈球菌屬84.8%HACEK84%酵母菌85.2%,J Clin Microbiol. 2010; 48: 900,四、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,核酸擴增及DNA序列分析PCR是一種體外核酸擴增技術(shù)。目前,PCR已成為分子生物學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域的經(jīng)典試驗方法。PCR在血流感染微生

27、物檢測和鑒定中的應(yīng)用體現(xiàn)在3個方面：一是對純的病原菌鑒定；二是對血培養(yǎng)陽性培養(yǎng)物快速鑒定；三是對臨床標(biāo)本中難以培養(yǎng)病原菌進(jìn)行檢測和鑒定?？赏ㄟ^2種方式檢測和鑒定病原微生物，一是使用特異引物擴增檢測病原微生物目標(biāo)基因；二是使用通用引物擴增檢測細(xì)菌16SrRNA和真菌 ITS及5.8S、26SrRNA等基因D1/D2序列，同時進(jìn)行測序分析,Kary B. Mullis,The Nobel Prize in Chemistry 199

28、3,陽性血培養(yǎng)－基于PCR的檢測,PCR特異性檢測病原特異性PCR特定耐藥基因檢測：葡萄球菌mecA, 腸球菌van細(xì)菌載量：肺炎鏈球菌自溶毒A基因lytA拷貝數(shù)廣譜檢測：PCR擴增特定靶位多態(tài)性分析測序后續(xù)基因檢測種特異性real-time PCR,Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209. Curr Opin Infect Dis. 2011, 24(2):

29、137,保守區(qū)——反應(yīng)親緣性可變區(qū)——反應(yīng)菌種間差異,廣譜性細(xì)菌/真菌感染核酸檢測-臨床應(yīng)用,檢測方法：核酸檢測 16s rDNA/18s rDNA-“細(xì)菌/真菌身份證”(每個細(xì)菌/真菌都有的一個基因),不明微生物感染病原體廣譜檢測,檢測方法：PCR + ABI 3730xl 測序法,檢測內(nèi)容,細(xì)菌16s /真菌18s 檢測,16s rDNA/18s rDNA-“細(xì)菌/真菌身份證”,臨床細(xì)菌/真菌檢測常用的方法,細(xì)菌/

30、真菌培養(yǎng),,生化表型檢測,,確定菌種,細(xì)菌16S分型——“細(xì)菌分型的金標(biāo)準(zhǔn)”,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測診斷血流感染1,Critical Care Medicine 2015,目的：選擇歐洲6個國家共9個ICU529名重癥感染患者所采集的標(biāo)本進(jìn)行血培養(yǎng)和分子生物學(xué)檢測，其中包括616份血流感染、185份肺炎及110份無菌區(qū)液體或組織的樣本，評價聚合酶鏈反應(yīng)檢測方法的潛在臨床意義,分子檢測技術(shù)用于血流感染、肺炎及無菌部位感染的危重病人快速診斷的多

31、中心研究,聚合酶鏈反應(yīng)檢測診斷血流感染1,在625份血流感染標(biāo)本中，PCR鑒定病原菌228例（37%），而血培養(yǎng)為68例（11%）。PCR的靈敏度為81%，特異性為69%，陰性預(yù)測值為97%。,Critical Care Medicine 2015,聚合酶鏈反應(yīng)檢測診斷血流感染1,結(jié)論：聚合酶鏈反應(yīng)/電噴霧質(zhì)譜檢測（PCR）技術(shù)可以作為血流感染快速識別病原菌的方法，6小時內(nèi)排查血流感染，具有潛在的臨床經(jīng)濟效益,Critical Care

32、 Medicine 2015,多重聚合酶鏈反應(yīng)診斷血流感染2,一項對照性研究，對263例疑似膿毒癥患者血標(biāo)本進(jìn)行血培養(yǎng)和多重PCR技術(shù)，檢測標(biāo)本中細(xì)菌和真菌病原體，對兩種檢測方法的檢測率、敏感性、特異性及分層狀況下的結(jié)果進(jìn)行對照分析，評價多重PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用價值。,,研究結(jié)果顯示在該研究263份病例中，確診感染41.5%，可能感染30.7%，余為無感染 以臨床表現(xiàn)作為參考標(biāo)準(zhǔn)時兩種檢測方法敏感性30%、NPV19%均低，而以血培

33、養(yǎng)作為參考標(biāo)準(zhǔn)時，PCR檢測的敏感性61%、特異性95%、NPV90，PPV76%在病原菌的鑒別數(shù)量方面血培養(yǎng)高于PCR（66/46），但對于血培養(yǎng)陰性的病例中PCR技術(shù)更顯優(yōu)勢在預(yù)先使用過抗生素的病例中，血培養(yǎng)檢測陽性率高于PCR技術(shù)檢測時間PCR技術(shù)明顯優(yōu)于血培養(yǎng),小 結(jié),血流感染的早期診斷和病原菌識別是減少細(xì)菌耐藥、降低死亡率前提優(yōu)化血培養(yǎng)提高BSI的診斷陽性率感染標(biāo)志物僅是反映BSI嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)分子生物學(xué)技術(shù)