血流感染實(shí)驗(yàn)室診斷新進(jìn)展

1、內(nèi)容,什么是血流感染？血流感染流行病學(xué)特點(diǎn)血培養(yǎng)流程優(yōu)化提高陽(yáng)性率分析培養(yǎng)結(jié)果減少污染分子生物學(xué)方法檢測(cè)血流感染基于PCR的技術(shù)MALDI-TOF MSPNA-FISH,概念,感染＝炎癥+病原體全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）體溫>38?C或90次/分呼吸頻率>20次/分，或PaCO212×109/L或10%膿毒血癥（sepsis）＝感染+SIRS，血培養(yǎng)可以陽(yáng)性或陰性重度膿毒血癥（sev

2、ere sepsis）＝sepsis+臟器功能障礙、組織灌注不良和低血壓感染性休克（septic shock）,概念,敗血癥（septicemia）：病原菌及其毒素侵入血流所引起的臨床綜合征，是一種嚴(yán)重的全身感染。病原菌主要是細(xì)菌，也可為真菌、分枝桿菌等。菌血癥（bacteremia）：細(xì)菌在血流中短暫出現(xiàn)的現(xiàn)象，一般無(wú)明顯毒血癥狀，在國(guó)外文獻(xiàn)中常與敗血癥通用。血流感染（bloodstream infection, BSI）：

3、敗血癥和菌血癥目前統(tǒng)稱為血流感染。,血流感染,醫(yī)院獲得性血流感染原發(fā)血流感染實(shí)驗(yàn)室證實(shí)血流感染（Laboratory-confirmed Bloodstream Infection, LCBI）臨床血流感染（Clinical Sepsis）繼發(fā)血流感染：血培養(yǎng)分離出有意義微生物，而且此微生物與另一部位之院內(nèi)感染有關(guān)。唯不包括血管或血管內(nèi)導(dǎo)管裝置所引起之血流感染。社區(qū)獲得性血流感染,實(shí)驗(yàn)室證實(shí)血流感染（LCBI）,標(biāo)準(zhǔn)一：從一次

4、或多次血標(biāo)本中培養(yǎng)出一種一致的致病菌，而且培養(yǎng)出的病原體與其它部位的感染無(wú)關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)二：病人至少具有下列癥狀和體征之一：發(fā)熱（>38 ?C ），寒顫或低血壓，并致病符合下列之一：1.從兩次或兩次以上不同部位抽血的標(biāo)本中培養(yǎng)出皮膚寄生菌（如類白喉?xiàng)U菌、芽孢桿菌、丙酸桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌或微球菌）。2.至少一次從帶血管內(nèi)導(dǎo)管的病人血標(biāo)本中培養(yǎng)出皮膚寄生菌群（如類白喉?xiàng)U菌、芽孢桿菌、丙酸桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌或微球菌），并且主

5、管醫(yī)生開始了適當(dāng)?shù)目咕幬镏委煛?.血中抗原檢測(cè)陽(yáng)性（如流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌或B群鏈球菌）。與實(shí)驗(yàn)室陽(yáng)性結(jié)果一致的癥狀和體征與其它部位的感染無(wú)關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)三：年齡38 ?C ），低溫（<37 ?C ），呼吸暫停、脈搏徐緩，并具有下列之一（同上3點(diǎn)略）,臨床血流感染（Clinical Sepsis）,具有下列二條件之一者：具有非其它已知原因所引起的發(fā)燒、血壓過(guò)低（收縮壓≤90mmHg或收縮壓低于平常超過(guò)40mmH

6、g），少尿（每小時(shí)尿量低于30ml）等臨床癥狀任何一項(xiàng)，且符合下列所有條件者：未做血培養(yǎng)，或血培養(yǎng)陰性或血液抗原反應(yīng)呈陰性者其它部位無(wú)明顯感染者醫(yī)生針對(duì)此感染中毒癥狀給予適當(dāng)抗菌藥物治療1歲以下嬰兒 ，具有非其它書籍原因引起的發(fā)燒、體溫過(guò)低、呼吸中止或心跳過(guò)緩等臨床癥狀任何一項(xiàng)，且符合下列所有條件者：未做血培養(yǎng)，或血培養(yǎng)陰性或血液抗原反應(yīng)呈陰性者其它部位無(wú)明顯感染者醫(yī)生針對(duì)此感染中毒癥狀給予適當(dāng)抗菌藥物治療,BSI流行病學(xué)

7、特點(diǎn),BSI發(fā)病率逐年增加凝固酶陰性葡萄球菌、腸球菌、真菌血流感染發(fā)病率逐年上升，革蘭陰性菌下降耐藥菌比例逐年增加社區(qū)獲得與醫(yī)院獲得血流感染病原譜存在差異院內(nèi)BSI患者病死率高,美國(guó)膿毒血癥流行病學(xué),,Martin et al, NEJM 2003;348:1546,加拿大CANWORD監(jiān)測(cè)2002-2009,Diag Microbiolo Infect Dis. 2011; 69: 307,加拿大CANWORD監(jiān)測(cè)2002-2

8、009,,Diag Microbiolo Infect Dis. 2011; 69: 307,,,,,美國(guó)49醫(yī)院BSI病原譜,,CID. 2004, 39: 309-317,PUMCH2012年834血培養(yǎng)分離株,PUMCH2012年144株BSI大腸埃希菌藥敏結(jié)果,ESBL 60.2%,PUMCH2012年67株BSI肺炎克雷伯菌藥敏結(jié)果,ESBL 34.4%,PUMCH2012年61株BSI鮑曼不動(dòng)桿菌藥敏結(jié)果,PUMCH2012

9、年76株BSI金黃色葡萄球菌藥敏結(jié)果,PUMCH2012年46株BSI草綠色溶血鏈球菌藥敏結(jié)果,2011CHIF-NET489株BSI酵母菌,,2011CHIF-NET念珠菌對(duì)氟康唑的敏感性,2011CHIF-NET念珠菌對(duì)伏立康唑的敏感性,2011CHIF-NET其他酵母菌對(duì)氟康唑的敏感性,2011CHIF-NET其他酵母菌對(duì)伏立康唑的敏感性,采血量是影響血培養(yǎng)陽(yáng)性率的獨(dú)立相關(guān)因素,CLSI M47-A：每位患者采集2~3套血培

10、養(yǎng)（40~60ml）Surviving Sepsis Campaign Guidelines (Worldwide)：抗菌藥物治療前至少采集2套血培養(yǎng)英國(guó)NHS血培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)：采集2套血培養(yǎng),采血量對(duì)血培養(yǎng)陽(yáng)性率的影響,JCM 2007,采血量對(duì)血培養(yǎng)陽(yáng)性率的影響,,J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047,J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047,,Routine S

11、et @ Mayo Clinic:2 BACTEC Aerobic Plus Bottles + 1 BACTEC Anaerobic Lytic Bottle,采血量和陽(yáng)性率,26,非條件致病菌,27,在多次血培養(yǎng)中單次培養(yǎng)下列細(xì)菌陽(yáng)性凝固酶陰性葡萄球菌棒狀桿菌微球菌丙酸桿菌芽孢桿菌如多次培養(yǎng)陽(yáng)性，可能為條件致病菌，需結(jié)合臨床分析,血培養(yǎng)污染菌,非條件致病菌,Mayo Clinic,,(p<0.001),為什么

12、需氧+厭氧？,28,Pathogen No.,兩種組合均能檢測(cè),,不同的病原菌,J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047,表皮葡萄球菌血培養(yǎng)陽(yáng)性意義,,CID 1997,,,,血培養(yǎng)陽(yáng)性時(shí)間－凝固酶陰性葡萄球菌,,,96%(+)86%單瓶（＋）,需氧瓶＝242厭氧瓶＝72需＋厭＝150,血培養(yǎng)陽(yáng)性時(shí)間－金黃色葡萄球菌,如何分析血培養(yǎng)凝固酶陰性葡萄球菌？,University Hospital o

13、f Base，2003－20073060陽(yáng)性血培養(yǎng)，654CNS，粒缺患者除外232 (35%)真正BSI，422 (65%)污染BSI由感染科醫(yī)生判斷，至少一份血培養(yǎng)CNS陽(yáng)性，有感染臨床表現(xiàn)SIRS: 體溫>38C or 90/min; 呼吸 >20/min; 白細(xì)胞>12 or 10% 未成熟中性粒細(xì)胞32%患者有1瓶以上CNS陽(yáng)性，BSI68 %，污染12% (p <0.001)沒有SIRS癥

14、狀：BSI 5%，污染29% (p <0.001),Clin Microbiol Infect. 2012 online,單瓶血培養(yǎng)CNS的BSI和污染患者區(qū)別,,Clin Microbiol Infect. 2012 online,,,單瓶血培養(yǎng)CNS陽(yáng)性BSI與臨床癥狀相關(guān)性,,Clin Microbiol Infect. 2012 online,,,,,Clin Microbiol Infect. 2012 online,降

15、低血培養(yǎng)污染率－－嚴(yán)格消毒,血培養(yǎng)瓶消毒：70%酒精消毒血培養(yǎng)瓶橡皮塞,待干60秒?；?0%異丙醇消毒干燥皮膚消毒：三步法70%酒精擦拭靜脈穿刺點(diǎn) >30秒1%?2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒：從穿刺點(diǎn)向外畫圈消毒,直徑>3cm70%酒精脫碘 一步法葡萄糖酸洗必泰作用30 s，或70%異丙醇消毒后自然干燥，但不適用于2個(gè)月以內(nèi)的新生兒。,急診血培養(yǎng)污染率與工作量相關(guān),The University of M

16、ichigan Health System急診血培養(yǎng)大多數(shù)由采血員采集，其次為護(hù)士和醫(yī)生采血員:病人= 1:9，重癥區(qū)護(hù)士:病人= 2:3，其它區(qū)域護(hù)士:病人=1:4年病人量82521人，采集血培養(yǎng)者7586人11.4%至少1瓶陽(yáng)性，病原菌陽(yáng)性率8.0%，污染率3.7%多套培養(yǎng)患者陽(yáng)性率7.4%，單套培養(yǎng)陽(yáng)性率5.1%（p<0.001），污染率無(wú)顯著差別（2.2% vs. 2.6%）,Schuyler Halverson

17、, et al. JCM. 2013 online,急診小時(shí)工作量,,Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online,繁忙時(shí)血培養(yǎng)污染率增加,,OR=1.23,OR=0.93,Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online,抗菌藥物治療與血流感染死亡率,死亡率,Chest 115 (2): 1999,血培養(yǎng)三級(jí)報(bào)告制度,血培養(yǎng)陽(yáng)性,終報(bào)告,,,革蘭染色,傳

18、種培養(yǎng),,,初步報(bào)告 (直接藥敏),鑒定菌株,,,電話報(bào)告,,鑒定＋標(biāo)準(zhǔn)藥敏,41,血培養(yǎng)結(jié)果回報(bào)對(duì)治療的影響,A = Appropriate Therapy(正確治療)I = Inappropriate Therapy(不正確治療),Clin Infec Dis 24:584-602, 1997,血流感染快速分子診斷,分子診斷不受抗菌藥物使用的影響血培養(yǎng)陽(yáng)性后分子診斷直接使用血標(biāo)本進(jìn)行分子診斷快速但不能提供藥敏結(jié)果,血

19、培養(yǎng)陽(yáng)性瓶分子鑒定,,Antigone Kotsaki, et al. Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209,陽(yáng)性血培養(yǎng)－基于PCR的檢測(cè),PCR特異性檢測(cè)病原特異性PCR特定耐藥基因檢測(cè)：葡萄球菌mecA, 腸球菌van細(xì)菌載量：肺炎鏈球菌自溶毒A基因lytA拷貝數(shù)廣譜檢測(cè)：PCR擴(kuò)增特定靶位多態(tài)性分析測(cè)序后續(xù)基因檢測(cè)種特異性real-time PCR,Expert Opin.

20、 Med. Diagn. 2012, 6(3):209. Curr Opin Infect Dis. 2011, 24(2):137,qPCR鑒定血培養(yǎng)陽(yáng)性瓶中銅綠假單胞菌,Target：ecfX gene血培養(yǎng)系統(tǒng)：BacT/ALERT，87瓶FA、13瓶FN，涂片均顯示G-b對(duì)照方法：氧化酶，API 20EDNA提?。?.5ml肉湯，離心后加裂解液，水煮法定量PCR：擴(kuò)增：Oligonucleotid

21、e primers基因特異性檢測(cè)：fluorescent-labeled hybridization probes，152bp fragment,Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21,46,qPCR鑒定血培養(yǎng)陽(yáng)性瓶中銅綠假單胞菌,33瓶pae，敏感性和特異性均為100%1瓶kpn+pae，由于pae (20CFU/ml)≤kpn (108CFU/ml)，PCR(-)檢測(cè)限：將ATCC

22、27853 ecfX基因克隆至TOP10 E.coli,Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21,,47,陽(yáng)性血培養(yǎng)－基于PCR的檢測(cè),最常見病原體多重PCR電泳譜、ELISA雜交、多重Real-time PCRHyplex BloodScreen (BAG, Lich, Germany): 多重PCR+ELISA, 4.5-6h完成Prove-It Sepsis (Mobidiag,

23、Helsinki, Finland)：多重real-time PCR+微陣列分析，檢測(cè)多種病原及mecA，3h完成多重Real-time PCR,Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209.,血培養(yǎng)陽(yáng)性－多重real-time PCR,,NEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 2013,血培養(yǎng)陽(yáng)性－多重real-time PCR,,NEW MICROBIOLOGICA, 36,

24、 65-74, 2013,血培養(yǎng)陽(yáng)性－PNA FISH核酸熒光原位雜交,血培養(yǎng)陽(yáng)性肉湯　　革蘭染色　　PNA FISH,,,革蘭陰性菌：商品化試劑盒eco/kpn/paeEfa/其它腸球Sau/scnCal/cgl/其它念珠菌報(bào)道Salmonella spp.90min PNA FISH完成,,Appl Environ Microbiol. 2010 ;76:4476 J. Clin. Microbiol. 20

25、13, 51(4):1301J Clin Microbiol. 2009; 47: 247,51,MALDI-TOF MS,基質(zhì)輔助激光解析電離（MALDI）原理：將樣品分散在基質(zhì)分子中形成結(jié)晶后直接進(jìn)樣，當(dāng)用激光照射結(jié)晶時(shí)，基質(zhì)吸收了激光的大部分能量，使基質(zhì)分子和樣品獲得能量投射到氣相并得到電離，成為帶電荷的離子。基質(zhì)在樣品離子形成過(guò)程中起到了質(zhì)子化或去質(zhì)子化的作用，使樣品帶上正電荷或負(fù)電荷，成為帶電荷的離子基質(zhì)會(huì)干擾被檢測(cè)分

26、子質(zhì)譜峰的大小和濃度；不同類型的分析物選擇不同的基質(zhì),MALDI-TOF MS,飛行時(shí)間（TOF）原理：離子源產(chǎn)生的離子在加速電場(chǎng)獲得動(dòng)能，當(dāng)進(jìn)入高真空無(wú)電場(chǎng)飛行管道并在此管道內(nèi)飛行時(shí)，質(zhì)量較輕的離子飛行速度快，早到達(dá)檢測(cè)器；質(zhì)量較重的離子飛行速度慢，晚到達(dá)檢測(cè)器。因此依據(jù)離子的飛行時(shí)間與其質(zhì)荷比平方根（m/z）成正比的關(guān)系，通過(guò)測(cè)定飛行時(shí)間，計(jì)算出相應(yīng)離子的分子量。,MALDI-TOF MS操作步驟,,MALDI-TOF MS快速鑒

27、定陽(yáng)性血培養(yǎng),使用菌落、陽(yáng)性血培養(yǎng)肉湯鑒定快速：20分鐘(從報(bào)警到鑒定出結(jié)果）MALDI-TOF MS(Bruker)+BACTEC(BD):正確鑒定：193/213陰性菌（包括厭氧菌）(90.61%)，284/319陽(yáng)性菌(89.02%)80.9%復(fù)數(shù)菌正確鑒定出一種，7株緩癥鏈球菌鑒定為spnMALDI-TOF MS(Bruker)+BacT/ALERT(bioMérieux):388個(gè)陽(yáng)性瓶，種正確率91%（

28、包括念珠、厭氧菌）15瓶復(fù)數(shù)菌：使用通用庫(kù)多鑒定出一種，革蘭染色后使用陰性或陽(yáng)性庫(kù)分析，6瓶鑒定出第二種菌,Clin Microbiol Infect 2010; 16: 1631　J Clin Microbiol 2010; 48: 1542,55,MALDI-TOF MS,VITEK MS(bioMérieux)以16s為金標(biāo)準(zhǔn)，980株臨床分離株，ID正確率腸桿菌科97.7%非發(fā)酵菌92%葡萄球菌屬94.3%

29、鏈球菌屬84.8%HACEK84%酵母菌85.2%,56,J Clin Microbiol. 2010; 48: 900,PCR/ESI MS,廣譜PCR－ESI MS（電噴射質(zhì)譜）189陽(yáng)性血培養(yǎng)和45陰性血培養(yǎng)，種一致率98.7%6例spn標(biāo)本方法陰性提供定量結(jié)果－－評(píng)估病原體載量假陰性率24%：幾乎均由混合感染導(dǎo)致5-6h完成檢測(cè)結(jié)合PCR的敏感性和ESI MS特異性可以直接檢測(cè)標(biāo)本，不需要培養(yǎng),Proc Na

30、tl Acad Sci. 2005;102:8012,血標(biāo)本分子檢測(cè),種特異性、屬特異性、廣譜、多重PCR、微陣列分析血培養(yǎng)陰性的苛養(yǎng)菌，如Bartonella spp.巴爾通體, Coxiella burnetii伯氏考克斯體, Mycoplasma spp.支原體, Chlamydia spp.衣原體, Ricketssia spp.立克次體，Tropheryma whipplei,商品化分子生物學(xué)檢測(cè)方法:血標(biāo)本,SeptiFa

31、st®(Roche)：multiplex real-time PCR，種屬特異性熒光探針，檢測(cè)重要血流感染致病菌SepsiTestTM® (Molzym)：eubacterial and panfungal real-time PCR， a 16S and 18S rRNA gene-based universal PCR+ sequencing，幾乎可以鑒定所有細(xì)菌、真菌VYOO® (SIRS Lab

32、)：multiplex PCR，檢測(cè)重要血流感染菌，電泳分離擴(kuò)增片段Plex-ID® (Abbott)：eubacterial and panfungal PCR+質(zhì)譜，幾乎可以鑒定所有細(xì)菌、真菌,59,Intensive Care Med. 2011 May, publish online.,SeptiFast test檢測(cè)的病原譜,,BMJ Open 2012;2:e000392Intensive Care Med (

33、2010) 36:49–56,SeptiFast test評(píng)估,,Intensive Care Med (2010) 36:49–56,,,SeptiFast與PCT、CRP相關(guān)性,,Langenbecks Arch Surg (2012) 397:447–455,VYOO®檢測(cè)能力評(píng)估,PLoS ONE. 2012,7 : e38916,Sepsis,非感染SIRS,血培養(yǎng)陽(yáng)性,血培養(yǎng)陰性，其它標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性,Sepsis,所

34、有培養(yǎng)陰性,VYOO®,與微生物學(xué)一致性為46.2%仍需改進(jìn),PLoS ONE. 2012,7 : e38916,3種商品化PCR檢測(cè)系統(tǒng)比對(duì),,Med Klin Intensivmed Notfmed 2013,3種商品化PCR檢測(cè)系統(tǒng)比對(duì),,Med Klin Intensivmed Notfmed 2013,分子生物檢測(cè)血標(biāo)本,幾乎所有與血培養(yǎng)對(duì)照的研究，都顯示更高的敏感性，但并非所有血培養(yǎng)陽(yáng)性菌一定能檢測(cè)出來(lái)不可替代

35、血培養(yǎng)！相較于血培養(yǎng)，其高敏感性可以更早地開始抗菌治療，或改變治療方案污染導(dǎo)致的假陽(yáng)性無(wú)法排除！評(píng)估血培養(yǎng)陰性的PCR陽(yáng)性結(jié)果分析其它微生物檢查結(jié)果（如BALF，傷口拭子等）免疫反應(yīng)指標(biāo),67,Intensive Care Med. 2011 May, publish online.,小結(jié),BSI發(fā)病率逐年升高，尤其是革蘭陽(yáng)性菌和真菌BSI病原菌耐藥率持續(xù)升高優(yōu)化血培養(yǎng)流程，提高陽(yáng)性率，降低污染率結(jié)合臨床分析血培養(yǎng)結(jié)果