布魯氏菌病實驗室診斷研究進展

1、GAOJIAOLUNTAN高教論壇92布魯氏菌病實驗室診斷研究進展高明華樊慶德徐春光楊曉剛（呼倫貝爾學院生命科學與化學學院內(nèi)蒙古呼倫貝爾021008）布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種重要人獸共患病。根據(jù)致病性和宿主特異性，將布魯氏菌分為6個種19個生物型，即羊種布魯氏菌(B.meltensis)、牛種布魯氏菌(B.abtus)、豬種布魯氏菌(B.suis)、綿羊附睪種布魯氏菌(B.ovis)

2、、犬種布魯氏菌(B.canis)和沙林鼠種布魯氏菌(B.neotomae)。另外，從海洋動物中分離到在致病性和分子特征上有別于前6種的布魯氏菌，定為海洋種布魯氏菌(B.maris)。據(jù)CDC報告，我國人布魯氏菌病發(fā)生嚴重，2005~2007年全國布魯氏菌病新發(fā)病人分別為18416、19013、21901例，2008年1~10月新發(fā)病數(shù)已達27264例，形勢十分嚴峻。流行病學調(diào)查表明，感染來源主要是患布魯氏菌病的羊，其次是牛及其他動物。并

3、且具有疫區(qū)范圍擴大、爆發(fā)點增多、典型病例增多、人群分布以農(nóng)民和牧民為主等特點。?為有效預防和控制人和動物布魯氏菌病，加強對動物布魯氏菌病的檢疫監(jiān)測力度十分重要。為此本文就布魯氏菌病實驗室診斷方法研究進展作以綜述。1免疫學免疫學診斷技斷技術1.1血清凝集性試驗布魯氏菌病傳統(tǒng)檢測方法有血清凝集試驗、全乳環(huán)狀試驗(MRT)和抗人免疫球蛋白試驗(Coomb’s)等。經(jīng)典血清凝集試驗包括標準試管凝集試驗(SAT)和平板凝集試驗(PAT)等在發(fā)達國

4、家已基本上停止使用，取代方法是緩沖布魯氏菌抗原試驗，如虎紅平板凝集試驗(RBT)等。在國際貿(mào)易中，緩沖布魯氏菌抗原試驗是牛、羊、豬種布魯氏菌病的指定試驗。乳牛MRT依然是乳牛布魯氏菌病監(jiān)測的主要方法。由于凝集性試驗是基于檢測針對布魯氏菌多糖O鏈的抗體，因此會與有類似多糖O鏈的細菌如耶爾森氏菌O:9等出現(xiàn)交叉反應。1.2補體結合試驗（CFT）CFT至今仍是布魯氏菌病診斷的重要方法，是牛、羊及綿羊附睪種布魯氏菌病國際貿(mào)易指定試驗，并作為確診

5、用。Adone等[2]以無抗補體活性的羊種布魯氏菌B115R型菌株為抗原建立檢測抗體的CFT(B115CFT)，并通過對RB51免疫的牛和水牛、綿羊附睪種布魯氏菌感染的羊和犬種布魯氏菌感染的犬血清中R型抗體進行檢測表明，B115CFT與RB51CFT和HSE(布魯氏菌熱鹽抽提物)CFT相比，具有很高的敏感性和特異性。由于豬的補體會干擾豚鼠補體的作用，導致實驗的敏基金項目：內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學校研究項目NJzy08165GAOJIAOLUN

6、TAN高教論壇94陰性符合率為99.6%。GICA檢測不同疫區(qū)之間人群抗體陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。說明GICA不僅能及時快速發(fā)現(xiàn)患者，而且可監(jiān)測疫情，反映流行程度，在布魯氏菌病不同流行區(qū)具有較好的推廣應用前景。2分子生物學分子生物學檢測檢測——PCR及其衍及其衍生技生技術PCR是布魯氏菌病分子生物學檢測和病原分型的重要手段，同時也是當今研究的熱點。早在1994年，Bricker等?根據(jù)布魯氏菌染色體中的遺傳成分IS711種

7、特異性定位引起的多態(tài)現(xiàn)象就建立PCR檢測方法，并根據(jù)在距IS711不同距離的引物雜交擴增產(chǎn)物大小來進行種型鑒定，能將布魯氏菌牛種(1、2、4型)、羊種(1、2、3型)、豬種(1型)、綿羊附睪種區(qū)分鑒別，并將該方法稱為AMOS(abtusmelitensisovissuis)PCR。后來他們改進了AMOSPCR，使之可以鑒別S19和RB51。?2003年Bricker等?在原有的基礎上又改進了AMOSPCR，建立了Bass(brucell

8、aabtusspeciesspecific)PCR，能從布魯氏菌疫苗株、其他種布魯氏菌和非布魯氏菌中區(qū)別牛種布魯氏菌流行株(1、2、4型)，是牛種布魯氏菌篩選的一種可信賴方法。Ocampo等?通過AMOSERYPCR和以IS711為探針的Southernblot雜交發(fā)現(xiàn)，牛3型除有牛3a外，還有牛3b生物型，進而用IS711AMOS作為引物擴增出長1.7kb產(chǎn)物，可以鑒別出牛3b型、牛5、牛6和牛9型。Whatme等?利用PCR擴增產(chǎn)物

9、長度多態(tài)性可以將布魯氏菌牛種、羊種、沙林鼠種、犬種、豬種、綿羊附睪種以及海洋種布魯氏菌區(qū)別開來。Fayazi等?用一個長度為25bp的引物，經(jīng)PCR擴增后豬種菌得到420bp產(chǎn)物，牛種菌得到420bp和650bp2個條帶，從而將豬種和牛種布魯氏菌鑒別開。Cloeckaert等?應用PCR擴增bp26基因得到1029bp和1900bp，其中1029bp為布魯氏菌6個種共有的產(chǎn)物，1900bp為海洋種布魯氏菌所特有。2001年，Cloeck

10、aert等?又發(fā)現(xiàn)利用omp2基因的多態(tài)性也可以將海洋種與其他布魯氏菌區(qū)分開。Redkar等?應用RealTimePCR鑒別了布魯氏菌的牛、羊、豬3個種。Probert等?也用RTPCR技術鑒別牛種、羊種和其他種布魯氏菌。Hini?等?建立的即可常規(guī)操作又可RealTimePCR的PCR新方法，特異性強，可鑒別6個種的布魯氏菌。Vladyslava等?應用PCR可以鑒別布魯氏菌的6個種，并能將豬4型單獨鑒別出來。Lpez等?建立了一種多

11、重PCR實驗(階梯法)，7個實驗室通過對來自不同動物和不同地區(qū)的625個布魯氏菌株的檢測表明，一步法可以鑒別古典布魯氏菌種，包括海洋種及疫苗株S19、RB51和Rev.1。Garcia等?用DdeⅠ消化omp31b基因擴增產(chǎn)物做PCRRFLP，通過對37株代表所有種和型的參考株和野毒株分析，可在種水平上鑒別牛種、羊種和綿羊附睪種布魯氏菌。Le等?應用多位點可變數(shù)串聯(lián)重復分析(MLVA)方法，使用MLVA15可以對布魯氏菌屬21個菌株進行