耐藥結(jié)核病的產(chǎn)生與實(shí)驗(yàn)室診斷(6.21)

1、,耐藥結(jié)核病的產(chǎn)生與實(shí)驗(yàn)室診斷2014年6月21日,,耐藥結(jié)核病產(chǎn)生,幾個(gè)與耐藥相關(guān)的概念,原發(fā)耐藥獲得（繼發(fā)）性耐藥自然耐藥交叉耐藥初始耐藥,單耐藥多耐藥耐多藥廣泛耐藥,幾個(gè)與耐藥相關(guān)的概念,原發(fā)耐藥：以前未接受過抗結(jié)核藥物治療而發(fā)生的耐藥。大多是受到耐藥病人的傳染而獲得的。獲得（繼發(fā)）性耐藥：原來對抗結(jié)核藥敏感的病例在治療過程中發(fā)生的耐藥。一般是治療不當(dāng)所致。初始耐藥：原發(fā)耐藥和不能肯定的獲得性耐藥的總稱，經(jīng)臨

2、床核實(shí)無法證明病人以往未曾接受過治療,幾個(gè)與耐藥相關(guān)的概念,自然耐藥：是野生株中存在的耐藥菌，在無藥物存在的條件下自然對抗結(jié)核藥物產(chǎn)生的耐藥。自然耐藥菌可因結(jié)核病治療用藥不當(dāng)、劑量不足、療程不充分等選擇性的生長發(fā)育，最終形成繼發(fā)耐藥菌。交叉耐藥：結(jié)核菌對一種藥物耐藥的同時(shí)對其他藥物也產(chǎn)生耐藥?？梢允莾煞N或多種藥物間的交叉。1314TH與1312TH完全交叉耐藥；氨基糖甙類單向交叉耐藥：耐SM對KM、AK敏感，耐KM對AK、CPM敏感；

3、氟喹諾酮類藥物間完全交叉耐藥，但對其他類無交叉耐藥；環(huán)絲氨酸和特立齊酮完全交叉耐藥，但對其他類無交叉耐藥。,幾個(gè)與耐藥相關(guān)的概念,單耐藥：結(jié)核分枝桿菌對一種抗結(jié)核藥物耐藥多耐藥：結(jié)核分枝桿菌對不包括同時(shí)耐R、H在內(nèi)的一種以上的抗結(jié)核藥物耐藥耐多藥：結(jié)核分枝桿菌至少同時(shí)對R、H耐藥廣泛耐藥(嚴(yán)重耐多藥）：結(jié)核分枝桿菌對R、H耐藥，同時(shí)對任何氟喹諾酮類藥物耐藥，以及至少對一種二線抗結(jié)核注射劑（CS、KM、AK）耐藥,耐藥結(jié)核病產(chǎn)生的原

4、因,細(xì)菌學(xué)、臨床及規(guī)劃的原因，本質(zhì)是人為造成的結(jié)果微生物學(xué)觀點(diǎn)，耐藥性是基因突變引起藥物對突變菌效力降低造成的，是由于敏感菌株被抗結(jié)核藥物殺死所誘發(fā)的某些菌群選擇性耐藥突變的結(jié)果臨床及管理方面，不足夠或不恰當(dāng)?shù)闹委煂?dǎo)致患者體內(nèi)耐藥突變菌成為優(yōu)勢菌,耐藥結(jié)核病產(chǎn)生的原因,細(xì)菌學(xué)原因：結(jié)核分枝桿菌在生長過程中可以自發(fā)、獨(dú)立的發(fā)生抗結(jié)核藥物耐藥的自然突變，但野生型菌株中突變率低，耐藥突變更低，在特定的野生型中耐異煙肼的突變3.5x10-

5、6耐利福平的突變1.2x10-8耐乙胺丁醇的突變3.1x10-5耐鏈霉素的突變3.8x10-6野生型中對一種以上藥物耐藥很少見，是兩率的積,耐藥結(jié)核病產(chǎn)生的原因,治療和管理原因：治療和管理不合理性是造成耐藥結(jié)核病最重要和最直接的原因，不合理性包括：結(jié)核病防治規(guī)劃組織執(zhí)行不到位，沒有按國家指南要求開展結(jié)核病防治工作沒有可靠的耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南沒有足夠培訓(xùn)缺乏對治療的監(jiān)測,耐藥結(jié)核病產(chǎn)生的原因,藥物聯(lián)合不合理、不恰當(dāng)用

6、藥劑量不足，服藥方法不當(dāng)療程不足或間斷用藥對失敗和復(fù)發(fā)的病例未做深入的分析和給予恰當(dāng)?shù)奶幚韺颊叩闹委熑狈芾砘蚬芾聿簧?耐藥結(jié)核病產(chǎn)生的原因,其他原因：患者的依從性差患者對結(jié)核病知識的了解不足抗結(jié)核藥物供應(yīng)不足，種類不全，質(zhì)量不佳，不良反應(yīng)重，生物利用度低等直接影響治療效果經(jīng)費(fèi)不足，患者經(jīng)濟(jì)困難是造成間斷、不規(guī)則用藥的重要原因新藥研制的緩慢,結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制,目前對結(jié)核分支桿菌耐藥機(jī)制研究很多，但仍然還沒完全搞清楚

7、，現(xiàn)在主要有以下3種觀點(diǎn)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與組成發(fā)生變化，使細(xì)胞壁通透性發(fā)生改變，藥物通透性降低，產(chǎn)生降解或滅活酶類，改變了藥物作用靶位結(jié)核分支桿菌中存在活躍的藥物外排泵系統(tǒng)，將菌體內(nèi)藥物泵出，使胞內(nèi)藥物濃度不能有效抑制或殺死細(xì)菌，從而產(chǎn)生耐藥性分子機(jī)制：結(jié)核分枝桿菌基因組上編碼藥物標(biāo)靶的基因或與藥物活性有關(guān)的酶基因突變，使藥物失效產(chǎn)生耐藥,耐藥結(jié)核病的流行,耐藥結(jié)核病是全球結(jié)核病控制工作的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球每年新產(chǎn)生耐多

8、藥結(jié)核病患者50萬人、廣泛耐藥患者約5萬人。能及時(shí)得到診斷者不足四分之一。我國結(jié)核患者數(shù)和耐多藥患者數(shù)均居世界第二位，,耐藥結(jié)核病的流行,2007-2008年我國進(jìn)行的耐藥基線調(diào)查結(jié)果：涂陽肺結(jié)核患者結(jié)核分枝桿菌總耐藥率為37.79%，其中初治總耐藥率為35.16%，復(fù)治總耐藥率為55.17%，總耐多藥（MDR-TB）率為8.32%，其中初治總耐多藥率為5.71%，復(fù)治總耐多藥率為25.64%，總廣泛耐藥（XDR-TB）率為0.68%

9、，其中初治患者為0.47%，復(fù)治患者為2.06%，根據(jù)此次調(diào)查結(jié)果估算，我國每年新發(fā)耐多藥肺結(jié)核患者12萬例，廣泛耐藥患者近1萬例。,耐藥結(jié)核病的流行,1999年我省結(jié)核分枝桿菌耐藥監(jiān)測結(jié)果，30個(gè)監(jiān)測點(diǎn)，總?cè)脒x病例1136例，培陽1097例，培陽率96.6%，涂陽培陰34例，3.0%，污染5例，污染率0.4%，未發(fā)現(xiàn)非結(jié)核分枝桿菌，1097例中初始859例，獲得238例，總耐藥率23.3%，初始耐藥率17.5%，獲得性耐藥率44.5%

10、，總耐多藥率6.4%，初始耐多藥率2.1%，獲得性耐多藥率21.8%。,,耐藥結(jié)核病診斷,藥敏試驗(yàn),目的：診斷 耐藥治療 監(jiān)測診斷耐藥結(jié)核病，滿足對臨床結(jié)核病患者耐藥情況的判定。選擇和調(diào)整耐藥結(jié)核病治療方案、制定有效的標(biāo)準(zhǔn)化或個(gè)體化治療方案。開展耐藥監(jiān)測了解某一地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的耐藥水平和流行趨勢。,藥敏試驗(yàn)方法,基于檢測標(biāo)本直接方法 直接用涂陽(涂片1+以上)標(biāo)本進(jìn)行試驗(yàn) 優(yōu)點(diǎn)：快速得到結(jié)果，較好地反應(yīng)病變

11、部位菌群的耐藥性； 缺點(diǎn)：污染難控制，容易失敗，很難確定接種量/菌活性。間接方法 使用培養(yǎng)物進(jìn)行藥敏試驗(yàn) 優(yōu)點(diǎn)：更好地控制接種量/菌活性 缺點(diǎn)：耗時(shí)長，及時(shí)性差,試驗(yàn)方法,世界衛(wèi)生組織推薦的藥敏試驗(yàn)方法基于生長觀察： 固體培養(yǎng)方法 比例法 絕對濃度法 抗性比率法基于生長檢測（產(chǎn)生二氧化碳、 消耗氧氣

12、等） 液體培養(yǎng)法基于基因突變檢測 探針雜交的方法 基因擴(kuò)增及序列測定,傳統(tǒng)試驗(yàn)方法,比例法 法國的 Canetti , 1963 在臨界藥物濃度下的耐藥比例，能夠更好的克服由接種量引起的變化 臨界菌群比＝耐藥菌群數(shù)/全菌群數(shù) 1% 、10% …絕對濃度法 德國的 Meisnner， 1963 標(biāo)準(zhǔn)化的接種量; 梯度的藥物濃度 臨界

13、藥物菌落數(shù)（10、20菌落）抗性比率法 英國 Mitchson， 1963 RR= MIC被檢菌/MICH37Rv克服了培養(yǎng)基中藥物濃度的控制 方法比較繁瑣，現(xiàn)在基本不怎么使用。,比例法和絕對濃度法的一致性,比例法和絕對濃度法目前是我國常用的藥敏實(shí)驗(yàn)方法，綜合以往國內(nèi)相關(guān)報(bào)道，兩種方法測試一線4種藥的一致性非常好，均達(dá)到了96%以上，耐藥率無顯著性差異。目前全球基金項(xiàng)目和國家對省級和省級對市級質(zhì)控都采用了比例法，也與跨國

14、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控方法一致，與國際上逐步實(shí)現(xiàn)了接軌。,開展傳統(tǒng)藥敏實(shí)驗(yàn)的要求,程序復(fù)雜: 必須在有質(zhì)量保證的通過熟練度測試的實(shí)驗(yàn)室中開展；必須按照高致病性病原微生物的要求進(jìn)行檢測；實(shí)驗(yàn)室應(yīng)為P2及以上級別的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)有生物安全柜和防止氣溶膠產(chǎn)生的儀器和設(shè)備；必須按標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程進(jìn)行試驗(yàn)；良好的個(gè)人防護(hù)措施以及定期對操作人員進(jìn)行體檢并進(jìn)行生物安全培訓(xùn)和教育；實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有完善的規(guī)章制度和應(yīng)急預(yù)案等。應(yīng)用：應(yīng)與PMDT的擴(kuò)展、治療策略和能

15、力相一致,不同實(shí)驗(yàn)室操作（韓國）實(shí)驗(yàn)室工作人員結(jié)核感染風(fēng)險(xiǎn)的比率,,比例法藥敏試驗(yàn)方法,比例法藥敏試驗(yàn)流程,對照培養(yǎng)基,含藥培養(yǎng)基,藥物儲存液,混合、搖勻,,,,基礎(chǔ)液改良L-J,,,,100ml,1ml,磨菌,分裝凝固,分裝凝固,,1mg/ml菌懸液,10-4 mg/ml,10-2 mg/ml,,,,,,100倍稀釋,100倍稀釋,接種0.01ml,,,,,接種0.01ml,2-3周新鮮菌落,,,,,,結(jié)果報(bào)告,計(jì)算耐藥百分比

16、： 含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)耐藥百分比= -------------------------- × 100% 對照培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù) 若耐藥百分比大于或等于1%，則認(rèn)為受試菌對該抗結(jié)核藥耐藥。,結(jié)果計(jì)算,對照管應(yīng)能計(jì)算出實(shí)際菌落數(shù)4周后觀察結(jié)果，如果生長不良，可稍延后報(bào)告結(jié)果，但不能超過6周.耐藥菌長的慢，藥效喪失）,結(jié)果報(bào)告,無藥 I

17、soniazid Ethambutol 接種物 培養(yǎng)基 0.2 mcg/ml 2.0 mcg/ml 10-3 ++++ ++ 3 10-5 26 9

18、 0 耐藥百分比％ 34.6 0.1 結(jié)果解釋 耐藥 敏感,影響藥敏試驗(yàn)準(zhǔn)確性的因素,實(shí)驗(yàn)室布局、設(shè)備、物資是否滿足要求負(fù)責(zé)培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)人員的能力工作量的保證藥物保存不當(dāng)、濃度計(jì)算錯(cuò)誤、效價(jià)計(jì)算不準(zhǔn)

19、確，稀釋不準(zhǔn)確影響藥物的實(shí)際濃度藥敏試驗(yàn)方法選擇不當(dāng)培養(yǎng)物：菌的新鮮程度、傳代次數(shù)、代表性,影響藥敏試驗(yàn)準(zhǔn)確性的因素,培養(yǎng)基：藥物加入到不同培養(yǎng)基后活性的改變（含藥培養(yǎng)基的制備），培養(yǎng)基中某些拮抗劑或化學(xué)物質(zhì)可干擾藥物的作用，培養(yǎng)基中藥物濃度變化（加熱失活、過濾除菌、不適宜的溶劑導(dǎo)致的不完全溶解）接種： 接種量、菌液的分散度（R、S）、代表性，稀釋度，菌的活性；穩(wěn)定的孵育條件孵育溫度和時(shí)間耐藥的標(biāo)準(zhǔn)藥敏試驗(yàn)結(jié)果的判讀,質(zhì)量控

20、制,若高稀釋度菌液（10-4mg/ml）在對照培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)少于20個(gè)菌落，則應(yīng)從對照管傳代培養(yǎng)，重復(fù)試驗(yàn)。每批試驗(yàn)以結(jié)核分枝桿菌參考菌株（H37Rv敏感株） 做為敏感對照，以檢測含藥培養(yǎng)基的質(zhì)量、稀釋和接種量等因素。,室內(nèi)質(zhì)控,對照培養(yǎng)基的質(zhì)控 可接種快速生長分枝桿菌，如偶然分枝桿菌，如接種后5天還未長出菌落，則培養(yǎng)基 未達(dá)到質(zhì)量要求。藥敏培養(yǎng)基的質(zhì)控 菌株H37Rv（ACTT27294）,實(shí)間質(zhì)控,藥敏試驗(yàn)的

21、熟練度測試 對進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的菌株進(jìn)行系統(tǒng)的（耐藥株）或隨機(jī)（敏感株）抽查，并采用雙盲進(jìn)行測試比較。,抗結(jié)核藥物敏感性試驗(yàn)熟練度測試,從2008年開始，省結(jié)核病參比室每年對宜昌、武漢、荊州、咸寧、黃岡五個(gè)地市結(jié)防院所結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行一、二線抗結(jié)核藥敏試驗(yàn)熟練度測試。2013年對全省16個(gè)地市結(jié)防專業(yè)機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室、耐藥定點(diǎn)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室、?？漆t(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培訓(xùn)和測試，除一個(gè)實(shí)驗(yàn)室一線藥，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室二線藥結(jié)果不合格外，其他實(shí)驗(yàn)室結(jié)果非常理想。

22、,藥敏試驗(yàn)的局限性,藥敏試驗(yàn)準(zhǔn)確性高低與測試的藥物有關(guān)； 對于一線藥物，INH、RFP準(zhǔn)確性高，而SM、EMB和PZA的可靠性和重復(fù)性較差。對于二線藥物如氨基糖苷類、多肽類和氟喹諾酮類的藥敏試驗(yàn)重復(fù)性和可靠性較好，其他二線藥尚無可靠的藥敏試驗(yàn)方法 可靠性差的原因與臨床反應(yīng)的相關(guān)性：臨界耐藥濃度、體外試驗(yàn)不一定完全反應(yīng)藥物在體內(nèi)的作用方法本身的復(fù)雜性和不穩(wěn)定性,藥敏試驗(yàn)的局限性,藥物濃度的不穩(wěn)定，蛋白結(jié)合、熱滅活、不完

23、全溶解、過濾除菌和藥物效價(jià)變化等均可導(dǎo)致藥物損失。實(shí)驗(yàn)操作、培養(yǎng)基的PH值、孵育的溫度和時(shí)間都可影響藥敏試驗(yàn)結(jié)果。二線藥敏試驗(yàn)的臨界濃度與藥物的最小抑菌濃度接近，加大了敏感和耐藥的錯(cuò)分幾率，導(dǎo)致可重復(fù)性較差。二線藥物有交叉耐藥，分子機(jī)制不詳。二線藥敏試驗(yàn)結(jié)果的解釋：報(bào)告耐藥：很有可能治療無效報(bào)告敏感：需要謹(jǐn)慎解釋（結(jié)合用藥史和臨床反應(yīng)）,說 明,醫(yī)生應(yīng)該詳細(xì)了解病人的病史、準(zhǔn)確記錄用藥史，用藥時(shí)間越長，耐藥的可能性就越高。

24、特別是常規(guī)治療期間出現(xiàn)臨床或細(xì)菌學(xué)治療失敗（涂陽或培陽）則高度提示耐藥的產(chǎn)生。如果病人治療超過1月仍涂陽或培陽，即使藥敏結(jié)果報(bào)告為敏感，也要考慮該藥物“可能耐藥”。如果某一藥物的既往用藥史提示可能由于耐藥而無效，即使實(shí)驗(yàn)室報(bào)告該藥敏感，也不能將其作為方案中的四個(gè)核心藥物。實(shí)驗(yàn)室報(bào)告耐藥，而病人從未使用過該藥物的可能性也存在，有可能感染的是原發(fā)性耐藥株，也可能是實(shí)驗(yàn)室的錯(cuò)誤或某些二線藥物藥敏試驗(yàn)特異性有限所致。,國家參比室推薦的耐藥新診斷

25、技術(shù),其他正在開發(fā)或評估的新技術(shù),耐藥分子診斷的基本原理,利福平/異煙肼耐藥性的產(chǎn)生與結(jié)核分枝桿菌特定基因某些位點(diǎn)的突變相關(guān)。,快速藥敏-商業(yè)化線性探針檢測（LPAs）,可使用涂陽痰標(biāo)本和培養(yǎng)物進(jìn)行操作快速（1天）需PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)施和技術(shù)不能檢測造成耐藥突變的熱點(diǎn)區(qū)域外的突變價(jià)格比較昂貴,42,43,去 污 染,DNA 提取,擴(kuò) 增,雜交,清洗，檢測顏色,結(jié)果解釋,LPA操作流程,關(guān)于LPA的建議,適用于地區(qū)及以上級

26、實(shí)驗(yàn)室 僅適用于涂陽標(biāo)本和結(jié)核分枝桿菌陽性培養(yǎng)物的檢測 操作需要至少有3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室以避免交叉污染 僅能檢測MDR，XDR的檢測仍需要依靠傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn) 可以獨(dú)立作為MDR的診斷工具 對于MDR病人，仍需要傳統(tǒng)的培養(yǎng)（固體或液體培養(yǎng)）檢測治療效果（培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)） 建議的覆蓋面: 每50－100萬人口至少需要1個(gè)LPA實(shí)驗(yàn)室,結(jié)核耐藥檢測基因芯片,激光共焦掃描儀,軟件判讀,結(jié)核耐藥檢測芯片獲北京市自主創(chuàng)新產(chǎn)品證書,樣品制

27、備儀,雜交儀,通 量：兩個(gè)一線抗結(jié)核藥速 度： 6 小時(shí)（比傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)法快 50-100 倍）靈敏度：103 CFU/反應(yīng)特異性：對照設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)；自動(dòng)判讀,基于rpoB/katG/inhA的基因突變，快速檢測分離株或者痰樣本中結(jié)核桿菌多藥耐藥（利福平、異煙肼）。,International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 13:914-920, 2009（IF=2.3

28、）,45,獲國家醫(yī)療器械證書和歐盟CE認(rèn)證,基因芯片,基因芯片是指采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將核酸片段有序地固化于支持物的表面，然后與已標(biāo)記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。,檢測過程,芯片結(jié)果圖例,芯片雜交質(zhì)控,國家推薦意見,在地市級以上結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室使用用于涂陽患者或者陽性培養(yǎng)物,Xpert MTB/RIF,檢測結(jié)核分枝桿菌檢測利福平

29、耐藥直接標(biāo)本檢測100分鐘可獲得結(jié)果,Xpert MTB/RIF,,,生物安全要求低敏感度和培養(yǎng)類似特異度高快速 (< 2 小時(shí))設(shè)備輕便操作簡單,,,成本高設(shè)施設(shè)備耐藥的陽性預(yù)測值取決于P利福平耐藥率利福平耐藥 ≠ MDR-TB,WHO關(guān)于Xpert MTB/RIF的建議,Xpert MTB/RIF 應(yīng)該用于懷疑MDR-TB的病人、以及HIV合并結(jié)核的病人的最初診斷（強(qiáng)烈推薦）Xpert MTB/RIF

30、在MDR或HIV問題不十分嚴(yán)重的地區(qū)，可以考慮作為顯微鏡檢查基礎(chǔ)之上的后續(xù)檢測，特別是用于涂陰標(biāo)本的進(jìn)一步檢測（根據(jù)具體情況推薦，需考慮當(dāng)?shù)氐馁Y源）,說明:,Xpert MTB/RIF適用于痰標(biāo)本（包括去污染后的痰標(biāo)本），肺外標(biāo)本應(yīng)用 Xpert MTB/RIF 的研究十分有限。增加檢測次數(shù)可能會增加Xpert MTB/RIF的敏感性，但是需要考慮資源情況上述建議也適用于兒童不能取代傳統(tǒng)的涂片檢查、培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)（治療監(jiān)測、流行病

31、學(xué)調(diào)查、其他一線藥物以及二線藥物的藥敏試驗(yàn)）在MDR低風(fēng)險(xiǎn)組（如新病人）Xpert MTB/RIF檢測結(jié)果為利福平耐藥者，建議用傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)或LPA進(jìn)行確認(rèn),分子耐藥檢測優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：快速、微量，敏感度、特異度較高缺點(diǎn)：1、檢測的突變位點(diǎn)有限，常只能檢出部分熱點(diǎn)突變，因此對RFP陽性檢出率為90%，INH為70%以上2、檢出的藥品種類有限3、多數(shù)方法操作較繁瑣，影響因素較多，需要專門設(shè)備，且設(shè)備、檢測試劑價(jià)格較貴，臨床應(yīng)用還存