結核病的實驗室診斷分析

1、結核病的實驗室診斷,主要內容,,結核病的分子藥敏,4,1.結核病的流行概況,全球范圍內結核病疫情急劇惡化人口大規(guī)模流動結核菌耐藥現象益發(fā)嚴重 結核病合并艾滋病感染我國是世界上僅低于印度的第二結核病大國結核菌感染率44.5%新發(fā)活動性結核患者130萬/年死亡13萬/年,,2011 WHO tuberculosis control report,我國是全球27個耐藥結核病高負擔國家之一2013年世界衛(wèi)生組織宣布全球耐多藥結核

2、病緊急狀態(tài),全球的結核病患者,在接受治療之前已經傳染給了別人?。。?早期快速診斷與治療成為制約結核病控制的關鍵：有細菌學診斷依據的病人不超過50%,當前結核研究的熱點,新型抗結核藥物(50%)新型快速診斷技術(40%)新型結核疫苗(10%),7/45,近期結核病診斷方法的相關研究,,JID 2012:205 (Suppl 2), S147.,,,2.結核病的病原學,結核分枝桿菌(M.tuberculosis)是引起人類結核病的主要病

3、原體。1882年由德國醫(yī)生Koch發(fā)現。結核分枝桿菌屬于厚壁門、裂殖菌綱、放線菌目、分枝桿菌科、分枝桿菌屬。分枝桿菌復合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型結核分枝桿菌是人類主要的致病菌。,2024/3/8,GDTB,8,,結核分枝桿菌(M.tuberculosis),生物學主要特點：1. 細胞壁中含有大量脂質2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽腫3.抗酸染色陽性,生長特點：生長緩慢，繁殖一代在人工培養(yǎng)基內約需要15～2

4、0小時，在靜脈感染未經免疫小鼠肺中約需要15小時，在巨噬細胞內約需要15～20小時，在家兔角膜中約需要20～22小時。,實驗室檢查方法的歷史,1880sTubercle bacilli的發(fā)現 Ziehl-Neelsen染色方法1900sMantoux test (TST with tuberculin)1920sPetragnani medium Purified Protein De

5、rivative（PPD）1930sLewenstein-Jensen 培養(yǎng)基1940sDubos agar, Ogawa 培養(yǎng)基1950sMiddlebrook 7H91990sNAAT2000sELISPOT, QuantiFERON,2010sLPA, GeneXpert2020s ???,3.結核病的實驗室診斷,細菌學,涂片：敏感性低,傳統(tǒng)固體培養(yǎng)：所需時間長，2~3月,分子生物學,T

6、B-DNATB-mRNA,血清/免疫學,IGRA：有望替代TST，但不能區(qū)分活動性TB與潛伏感染,血清學：存在抗原純度和特異性差等方面的問題,,液體培養(yǎng)及藥敏試驗：平均時間20天,,,①.細菌學診斷,,萋尼氏染色,熒光染色,,,羅氏培養(yǎng)/藥敏試驗,,,我國目前最常用的結核病實驗室診斷技術,,快培/藥敏試驗,,,涂片 ? 干燥 ? 固定,,,,,初染,脫色,復染,顯微鏡檢查,,登記/報告,顯微鏡檢查,,,堿性復紅,鹽酸酒精,亞甲蘭,石

7、炭酸金胺O,鹽酸酒精,高錳酸鉀,光學顯微鏡檢查,熒光顯微鏡檢查,,,,,,,萋尼氏染色鏡下形態(tài),熒光染色鏡下形態(tài),,LED Fluorescence microscopyLED熒光顯微鏡,,LED 熒光顯微鏡,成本低廉的超亮發(fā)光二極管可承受的價格，價格接近于現有的光學顯微鏡壽命長（~ 15-20,000小時）省電可用電池供能可靠性更強不需要空調設施不需要暗室診斷性能優(yōu)于標準熒光顯微鏡操作人員工作負荷減輕,普通熒光顯微

8、鏡和發(fā)光二極管熒光顯微鏡性能比較（不同實驗室的結果進行匯總與平均）,培養(yǎng)/藥敏試驗,,陰性培養(yǎng),陽性培養(yǎng),BACTEC? MGIT? 960/320 指示器系統(tǒng),MGIT /3D制造的液體培養(yǎng)基,優(yōu)點比固體培養(yǎng)快 (平均 10-12 天 vs. 20-24 天)比固體培養(yǎng)基更敏感可以自動判讀，或使用標準指示管和操作手冊進行判讀也加快了藥敏試驗的速度局限需要NALC-NaOH進行痰處理和離心普通菌群的污染很常見比固體培

9、養(yǎng)更經常地檢出非結核分枝桿菌（常常不致?。┐_定診斷前必須對所有的陽性培養(yǎng)物進行結核分枝桿菌的鑒定比固體培養(yǎng)基昂貴,②血清學診斷,血清學診斷技術優(yōu)勢：是一種對疾病進行早期診斷的理想方法。無需活細胞培養(yǎng)和特殊儀器設備操作簡便結果顯示快速目前用于血清學診斷的主要方法:酶聯免疫吸附試驗(ELlSA)斑點金免疫滲濾法(DIGFA)免疫印跡法(Western Blotting)等等,WHO對來自不同國家的19種試劑盒產品進行評估，

10、結果表明：與痰培養(yǎng)相比，這些試劑盒檢測的靈敏度為1%~60%，特異度為53~99% 1 。原因：由于所用的測定方法、使用的試劑種類或抗原、抗體的不同等，導致測定結果差異較大，并且缺乏可比性。WHO認為現有的血清學診斷試劑的敏感度和特異度都有待進一步提高，不推薦其作為一種快速診斷的方法在臨床使用。1WHO World Health Organization. Diagnosis evaluation series No.2: lab

11、oratory-based evalution of 19 commercially available rapid diagnostic tests for tuberculosis.2008.,WHO對結核抗體評估,2011年WHO正式公告：由于目前的商業(yè)血清學試劑在結核檢測中存在較大差異，且檢測結果很高比例的假陽性和假陰性，因此不建議使用血清學方法作為結核桿菌的診斷實驗1 。1WHO Commercial Serodiagnos

12、tic Tests for Diagnosis of Tuberculosis. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241502054_eng.pdf不能早期診斷！容易漏診、誤診！,血清學檢測的評價,結核感染者體內存在特異的效應T淋巴細胞，效應T淋巴細胞再次受到結核抗原刺激時會分泌多種細胞因子（IFN-γ）。因此，檢測效應T淋巴細胞可用于結核病或結核潛伏感染者的診斷。由于

13、效應T細胞存活時間很短，而且具有特異性，因此可以作為機體是否正處于被感染的指標，無論是否有臨床癥狀?；贗GRA原理的產品目前已被美國、加拿大、英國、德國、意大利、瑞士、法國、荷蘭、日本等二十余個國家寫入本國的結核診療指南中。目前應用的進口IGRA主要有兩種商品化的試劑：1）澳大利亞Cellestis公司的 Quanti FERON-TB GOLD In Tube（QFT-GIT）2）英國Oxford Immunotec公司的T

14、-SPOT.TB,蛋白水平分子診斷:γ-干擾素釋放實驗（IGRA),,γ-干擾素釋放實驗（IGRA）,,γ 干擾素檢測陰性,γ干擾素檢測陽性,T-SPOT®.TB原理,T-SPOT®.TB是以擁有專利的特異抗原（ESAT-6/CFP-10），通過酶聯免疫斑點技術（ELISPOT）檢測受試者體內是否存在結核效應T淋巴細胞，從而判斷目前該受試者是否感染結核桿菌（現癥感染）的新方法。結核桿菌特異抗原：早期分泌抗原靶

15、6（Early Secreted Antigenic Rarget 6，ESAT-6）培養(yǎng)濾液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10，CFP 10）,,結核桿菌特異抗原,,由結核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丟失該基因序列絕大多數的環(huán)境分枝桿菌也不存在RD1區(qū),ESAT-6與CFP-10抗原,結核桿菌特異抗原,,蘇氏,海,堪薩斯,戈登,牛,非洲,T-SPOT®.

16、TB臨床性能指標,特異性只針對結核分枝桿菌復合群敏感，與絕大多數環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無交叉反應 美國FDA數據：特異性97.1%(297/306) 國內臨床數據：特異性94.1%(478/508) 靈敏度基本不受免疫力低下/受抑制影響，在肺外結核患者中有很高的檢出率 美國FDA數據：靈敏度95.6%(175/183)

17、國內臨床數據：靈敏度95.3%(624/655),,靈 敏 度,,特 異 性,,T-SPOT®.TB的實驗步驟,,用BD CPT 管或Ficoll提取液收集外周血單個核細胞,結核特異抗原（ESAT-6/CFP 10）刺激結核特異的效應T淋巴細胞使其分泌γ-干擾素,效應T淋巴細胞分泌的γ-干擾素與膜板預包被的抗γ-干擾素抗體結合并固定在細胞周圍,1個斑點=1個效應T細胞,加入顯色液，觀察結果,過夜孵育，洗板，加入酶標二抗,,實驗

18、效果圖,方法學的優(yōu)點,檢測特異性的提高幫助臨床區(qū)分卡介苗接種和環(huán)境分枝桿菌感染引起的“假陽性”，避免了臨床的無效用藥檢測靈敏度的提高有利于臨床對結核病的早發(fā)現、早治療，避免了疾病的傳播與擴散快速48小時出結果,,方法學的局限,不能區(qū)分活動性TB與潛伏感染不能夠提示臨床患者的病變部位，需要結合臨床的判斷目前還不能夠根據斑點數量的多少來判斷患者是活動性結核病或是潛伏感染者檢測收費高（800元/次）,,實驗結果的解釋,陰性結果

19、提示患者體內不存在針對結核桿菌特異的效應T細胞。假陰性結果：①感染階段不同；②少數免疫系統(tǒng)功能不全/疾病；③實驗非正常操作。 陽性結果提示患者體內存在針對結核桿菌特異的效應T細胞，患者存在結核感染。但是否是活動性結核病，需結合臨床癥狀和其它檢測指標綜合判斷。假陽性結果：① 4種環(huán)境分枝桿菌感染時：M.kansasii（堪薩斯）、M.szulgai（蘇氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）,,各國對潛伏

20、感染風險人群的篩查指南,,樣本量為26 680 調查者的15個多中心研究顯示,在4年的隨訪中,IGRA-陽性的個體中發(fā)病數為4~48 例/1000人/每年.,2011年9月的研究結果提示，IGRA-陰性對于兒童（小于5歲）不能排除結核病(Pediatr. Infect. Dis. J.30, 817–818, 2011). Childhood tuberculosis treatment remains imprecise scien

21、ceNature MedicineVolume:17,Page:116011 October 2011.,TB-DNA檢測：1. 能穩(wěn)定檢測10copy的TB-DNA ，靈敏度高 ，特異性強。2. 早期、快速、準確地診斷結核病。 痰液、肺及支氣管灌洗液——肺結核 血液——播散性結核和各臟器的結核病 　 腦脊液——中樞神經系統(tǒng)結核病 宮頸拭子、尿道拭子—

22、—泌尿生殖道結核病3. 熒光定量PCR檢出結核桿菌陽性率顯著高于痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)法。4. TB-DNA濃度可用于判斷療效： 痰標本中結核桿菌的數量呈逐漸下降趨勢 ，TB-DNA拷貝數下降。根據病原體DNA濃度，對藥物治療及療效觀察提供參考依據 。,③分子生物學診斷,,,Real-time PCR,環(huán)介導等溫擴增法(LAMP)的技術特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計4 條特異引物，利用一種鏈置換DNA

23、聚合酶在等溫條件(63-65℃)下保溫30－60分鐘，即可完成核酸擴增反應。與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，具有簡單、快速、特異性強的特點。,環(huán)介導恒溫擴增（LAMP）技術,2小時全過程,目測法檢測流程,檢測方法說明,結果判斷,在陰性對照反應管液體顏色呈橙色，陽性對照反應管液體顏色呈綠色的條件下： 若待檢樣本反應管中液體顏色呈綠色，則可報告該樣本檢測結果為結核分枝桿菌陽性； 若待檢

24、樣本反應管中液體顏色呈橙色，則可報告該樣本檢測結果為結核分枝桿菌陰性； 若陰陽性對照反應管結果與上述情況不符，則本次檢測結果無效，應重新檢測。,RNA作為臨床分子診斷靶標的優(yōu)點：,RNA 拷貝數≥ DNA拷貝數更具臨床意義: 生命力旺盛的病原體RNA轉錄活躍RNA遠不如DNA穩(wěn)定病原體死亡，RNA很快降解 1.交叉污染少 2.較好的愈后指標,結核桿菌RNA(TB-RNA),SAT技術原理,操作過

25、程,4. 結核病的分子藥敏,HAIN 技術,DNA?STRIP®,T-spot,-Xpert MTB/ RIF,DNA微陣芯片,探針熔解曲線技術,原理：采用線性探針技術（LiPA），擴增后的產物與預先固化在膜上的特異性探針雜交，通過顯色反應判斷結果。檢測標本：涂陽痰標本/TB-DNA陽性標本固體或液體培養(yǎng)菌株,① Hain 技術,GT-Blot 48自動雜交儀1臺,所需設備：,GTQ PCR－96擴增儀1臺,Mikro

26、 220 離心機1臺,恒溫器1臺,超聲波振蕩儀1臺,TARGET,MTBDRplus 方法,原理：PCR擴增檢測rpoB、katG和inhA基因突變位點，診斷RFP和INH耐藥。,,rpoB 野生型探針: WT1 - WT8rpoB 耐藥突變探針: MUT1-3: D516V, H526Y, H526D, S531L→ 通過缺失的野生型信號進行突變探測→ 通過出現的突變信號進行突變探測,MTBDRplus rpoB,,,MTBDR

27、plus 操作流程,DNA提取用NALC/NaOH處理痰標本,2) PCR擴增,3) 雜交擴增產物和固化在膜上的特異性探針雜交,4) 結果判讀,MTBDRplus 反應條帶(示范),,,Bandelette MTBDR® (Hain Lifescience),,鑒定結核菌,,利福平rpoB,INHkatG 315,,,,,靈敏度：86.5% (45/52)特異度：100%(16/16)符合率：89.7%(61/

28、68),菌株標本 GenoType MTBDRplus方法與比例法藥敏試驗結果比較,靈敏度：98.0% (48/49)特異度：100%(16/16)符合率：98.5%(64/65),菌株標本 GenoType MTBDRplus方法與比例法藥敏試驗結果比較,痰標本（涂片陽性）GenoType MTBDRplus方法與比例法藥敏試驗結果比較,靈敏度：98.4% (63/64)特異度：100%(129/129)符合率：99.5%(1

29、92/193),痰標本（涂片陽性）GenoType MTBDRplus方法與比例法藥敏試驗結果比較,靈敏度：95.1% (39/41)特異度：92.1% (140/152)符合率：92.7% (179/193),優(yōu)點：Hain 技術可以快速檢測RFP和INH的耐藥時間短、操作簡單、安全高 特異性和靈敏度較高、重復性好主觀因素影響小、更為可靠,缺點:需要專門設備；未發(fā)現所有的耐藥突變位點，不能檢測所有藥物的耐藥基因型；M

30、TBDR plus試劑盒的檢測試紙條，缺少ahpC-oxyR間隔序列范圍，否則可進一步提高INH耐藥檢測的敏感性；不能取代傳統(tǒng)細菌學檢測、只能作為參考。,進行標本處理、實時PCR和利福平耐藥性檢測的完整平臺此平臺由FIND和Cepheid（一個加州公司）所開發(fā)痰標本可以直接放入模塊中，而無需與任何試劑進行混合處理GeneXpert 設備可進行標本液化、去污染、富集、DNA提取、 rpoB實時擴增、應用分子燈塔檢測耐藥相關的突變

31、該系統(tǒng)非常容易使用，不需要進行分子生物學培訓該檢測方法另外一個特點是操作完全自動化，使用起來既容易又安全。,②. Xpert MTB/RIF,設計五個重疊的分子信標，檢測81堿基 rpoB核心區(qū)域所有可能的突變用不同的熒光基團標記每個分子信標，使僅在一個反應中完成整個檢測成為可能探針能檢測野生型菌株（RIF-敏感人群）；ropB突變造成特定信標的信號丟失 （RIF-耐受人群）每個探針必須：能檢測野生型菌株；不能檢測Rif耐

32、藥突變菌株，不能檢測出非TB分枝桿菌.,Xpert MTB/RIF的引物設計,Xpert MTB/RIF,WHO推薦,Xpert MTB/RIF 與 Hain的比較 ：,只能做TB-DNA和利福平耐藥基因；只能通過8個缺失的野生型信號進行突變檢測，不能探檢測出現的突變信號；樣本通量少(4個/次）；所需樣本量大（1mL/次）；儀器斷電后只能重新開始； Hain有記憶功能。維護：剛進入中國市場，故障后只能返廠修理，費用昂貴。,③.

33、 DNA微陣芯片,基本原理：與Southern、Northern是一致的，都是應用已知核酸序列作為探針固定在玻璃等基片上，然后與待測樣品的DNA或RNA互補的靶核苷酸序列雜交，從而獲得待測樣品的信息,基因芯片的檢測過程,,,,結核耐藥快速檢測基因芯片,73,結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒（DNA微陣列芯片法）基于rpoB/katG/inhA的基因突變，快速檢測分離株或者痰樣本中結核分枝桿菌多藥耐藥（利福平、異煙肼）通 量：兩種

34、一線抗結核藥物、8個突變位點速 度：6小時versus 傳統(tǒng) 4~8 周靈敏度： 103 CFU/反應特異性：防污染體系；對照設計嚴謹；自動判讀,發(fā)表文章：The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 2009, 13(7): 914–920.發(fā)明專利：申請?zhí)枺?200810105172.X。授權公告號：CN 101285062 B。,1.晶芯

35、74;分枝桿菌核酸檢測試劑盒2.晶芯®十七種分枝桿菌菌種鑒定試劑盒3.晶芯®分枝桿菌耐藥檢測試劑盒4.晶芯®九項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒,DNA微陣芯片,④.探針熔解曲線技術,,檢測結果判斷,,Sputum,,涂片,培養(yǎng)—孵育8周（陽性）,藥敏試驗—觀察 孵育4周觀察生長情況,涂片/TB-DNA/ TB-RNA （陽性）,分子診斷/藥敏技術,液體培養(yǎng)及藥敏試驗,,,,,,平均時間2-3個月,,平