結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷分析

1、結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷,主要內(nèi)容,,結(jié)核病的分子藥敏,4,1.結(jié)核病的流行概況,全球范圍內(nèi)結(jié)核病疫情急劇惡化人口大規(guī)模流動(dòng)結(jié)核菌耐藥現(xiàn)象益發(fā)嚴(yán)重 結(jié)核病合并艾滋病感染我國是世界上僅低于印度的第二結(jié)核病大國結(jié)核菌感染率44.5%新發(fā)活動(dòng)性結(jié)核患者130萬/年死亡13萬/年,,2011 WHO tuberculosis control report,我國是全球27個(gè)耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一2013年世界衛(wèi)生組織宣布全球耐多藥結(jié)核

2、病緊急狀態(tài),全球的結(jié)核病患者,在接受治療之前已經(jīng)傳染給了別人?。?！,早期快速診斷與治療成為制約結(jié)核病控制的關(guān)鍵：有細(xì)菌學(xué)診斷依據(jù)的病人不超過50%,當(dāng)前結(jié)核研究的熱點(diǎn),新型抗結(jié)核藥物(50%)新型快速診斷技術(shù)(40%)新型結(jié)核疫苗(10%),7/45,近期結(jié)核病診斷方法的相關(guān)研究,,JID 2012:205 (Suppl 2), S147.,,,2.結(jié)核病的病原學(xué),結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)是引起人類結(jié)核病的主要病

3、原體。1882年由德國醫(yī)生Koch發(fā)現(xiàn)。結(jié)核分枝桿菌屬于厚壁門、裂殖菌綱、放線菌目、分枝桿菌科、分枝桿菌屬。分枝桿菌復(fù)合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型結(jié)核分枝桿菌是人類主要的致病菌。,2024/3/8,GDTB,8,,結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis),生物學(xué)主要特點(diǎn)：1. 細(xì)胞壁中含有大量脂質(zhì)2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽腫3.抗酸染色陽性,生長(zhǎng)特點(diǎn)：生長(zhǎng)緩慢，繁殖一代在人工培養(yǎng)基內(nèi)約需要15～2

4、0小時(shí)，在靜脈感染未經(jīng)免疫小鼠肺中約需要15小時(shí)，在巨噬細(xì)胞內(nèi)約需要15～20小時(shí)，在家兔角膜中約需要20～22小時(shí)。,實(shí)驗(yàn)室檢查方法的歷史,1880sTubercle bacilli的發(fā)現(xiàn) Ziehl-Neelsen染色方法1900sMantoux test (TST with tuberculin)1920sPetragnani medium Purified Protein De

5、rivative（PPD）1930sLewenstein-Jensen 培養(yǎng)基1940sDubos agar, Ogawa 培養(yǎng)基1950sMiddlebrook 7H91990sNAAT2000sELISPOT, QuantiFERON,2010sLPA, GeneXpert2020s ???,3.結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷,細(xì)菌學(xué),涂片：敏感性低,傳統(tǒng)固體培養(yǎng)：所需時(shí)間長(zhǎng)，2~3月,分子生物學(xué),T

6、B-DNATB-mRNA,血清/免疫學(xué),IGRA：有望替代TST，但不能區(qū)分活動(dòng)性TB與潛伏感染,血清學(xué)：存在抗原純度和特異性差等方面的問題,,液體培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)：平均時(shí)間20天,,,①.細(xì)菌學(xué)診斷,,萋尼氏染色,熒光染色,,,羅氏培養(yǎng)/藥敏試驗(yàn),,,我國目前最常用的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù),,快培/藥敏試驗(yàn),,,涂片 ? 干燥 ? 固定,,,,,初染,脫色,復(fù)染,顯微鏡檢查,,登記/報(bào)告,顯微鏡檢查,,,堿性復(fù)紅,鹽酸酒精,亞甲蘭,石

7、炭酸金胺O,鹽酸酒精,高錳酸鉀,光學(xué)顯微鏡檢查,熒光顯微鏡檢查,,,,,,,萋尼氏染色鏡下形態(tài),熒光染色鏡下形態(tài),,LED Fluorescence microscopyLED熒光顯微鏡,,LED 熒光顯微鏡,成本低廉的超亮發(fā)光二極管可承受的價(jià)格，價(jià)格接近于現(xiàn)有的光學(xué)顯微鏡壽命長(zhǎng)（~ 15-20,000小時(shí)）省電可用電池供能可靠性更強(qiáng)不需要空調(diào)設(shè)施不需要暗室診斷性能優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡操作人員工作負(fù)荷減輕,普通熒光顯微

8、鏡和發(fā)光二極管熒光顯微鏡性能比較（不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果進(jìn)行匯總與平均）,培養(yǎng)/藥敏試驗(yàn),,陰性培養(yǎng),陽性培養(yǎng),BACTEC? MGIT? 960/320 指示器系統(tǒng),MGIT /3D制造的液體培養(yǎng)基,優(yōu)點(diǎn)比固體培養(yǎng)快 (平均 10-12 天 vs. 20-24 天)比固體培養(yǎng)基更敏感可以自動(dòng)判讀，或使用標(biāo)準(zhǔn)指示管和操作手冊(cè)進(jìn)行判讀也加快了藥敏試驗(yàn)的速度局限需要NALC-NaOH進(jìn)行痰處理和離心普通菌群的污染很常見比固體培

9、養(yǎng)更經(jīng)常地檢出非結(jié)核分枝桿菌（常常不致?。┐_定診斷前必須對(duì)所有的陽性培養(yǎng)物進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌的鑒定比固體培養(yǎng)基昂貴,②血清學(xué)診斷,血清學(xué)診斷技術(shù)優(yōu)勢(shì)：是一種對(duì)疾病進(jìn)行早期診斷的理想方法。無需活細(xì)胞培養(yǎng)和特殊儀器設(shè)備操作簡(jiǎn)便結(jié)果顯示快速目前用于血清學(xué)診斷的主要方法:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELlSA)斑點(diǎn)金免疫滲濾法(DIGFA)免疫印跡法(Western Blotting)等等,WHO對(duì)來自不同國家的19種試劑盒產(chǎn)品進(jìn)行評(píng)估，

10、結(jié)果表明：與痰培養(yǎng)相比，這些試劑盒檢測(cè)的靈敏度為1%~60%，特異度為53~99% 1 。原因：由于所用的測(cè)定方法、使用的試劑種類或抗原、抗體的不同等，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果差異較大，并且缺乏可比性。WHO認(rèn)為現(xiàn)有的血清學(xué)診斷試劑的敏感度和特異度都有待進(jìn)一步提高，不推薦其作為一種快速診斷的方法在臨床使用。1WHO World Health Organization. Diagnosis evaluation series No.2: lab

11、oratory-based evalution of 19 commercially available rapid diagnostic tests for tuberculosis.2008.,WHO對(duì)結(jié)核抗體評(píng)估,2011年WHO正式公告：由于目前的商業(yè)血清學(xué)試劑在結(jié)核檢測(cè)中存在較大差異，且檢測(cè)結(jié)果很高比例的假陽性和假陰性，因此不建議使用血清學(xué)方法作為結(jié)核桿菌的診斷實(shí)驗(yàn)1 。1WHO Commercial Serodiagnos

12、tic Tests for Diagnosis of Tuberculosis. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241502054_eng.pdf不能早期診斷！容易漏診、誤診！,血清學(xué)檢測(cè)的評(píng)價(jià),結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核抗原刺激時(shí)會(huì)分泌多種細(xì)胞因子（IFN-γ）。因此，檢測(cè)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞可用于結(jié)核病或結(jié)核潛伏感染者的診斷。由于

13、效應(yīng)T細(xì)胞存活時(shí)間很短，而且具有特異性，因此可以作為機(jī)體是否正處于被感染的指標(biāo)，無論是否有臨床癥狀。基于IGRA原理的產(chǎn)品目前已被美國、加拿大、英國、德國、意大利、瑞士、法國、荷蘭、日本等二十余個(gè)國家寫入本國的結(jié)核診療指南中。目前應(yīng)用的進(jìn)口IGRA主要有兩種商品化的試劑：1）澳大利亞Cellestis公司的 Quanti FERON-TB GOLD In Tube（QFT-GIT）2）英國Oxford Immunotec公司的T

14、-SPOT.TB,蛋白水平分子診斷:γ-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（IGRA),,γ-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（IGRA）,,γ 干擾素檢測(cè)陰性,γ干擾素檢測(cè)陽性,T-SPOT®.TB原理,T-SPOT®.TB是以擁有專利的特異抗原（ESAT-6/CFP-10），通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）檢測(cè)受試者體內(nèi)是否存在結(jié)核效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，從而判斷目前該受試者是否感染結(jié)核桿菌（現(xiàn)癥感染）的新方法。結(jié)核桿菌特異抗原：早期分泌抗原靶

15、6（Early Secreted Antigenic Rarget 6，ESAT-6）培養(yǎng)濾液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10，CFP 10）,,結(jié)核桿菌特異抗原,,由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丟失該基因序列絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌也不存在RD1區(qū),ESAT-6與CFP-10抗原,結(jié)核桿菌特異抗原,,蘇氏,海,堪薩斯,戈登,牛,非洲,T-SPOT®.

16、TB臨床性能指標(biāo),特異性只針對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群敏感，與絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無交叉反應(yīng) 美國FDA數(shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306) 國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：特異性94.1%(478/508) 靈敏度基本不受免疫力低下/受抑制影響，在肺外結(jié)核患者中有很高的檢出率 美國FDA數(shù)據(jù)：靈敏度95.6%(175/183)

17、國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：靈敏度95.3%(624/655),,靈 敏 度,,特 異 性,,T-SPOT®.TB的實(shí)驗(yàn)步驟,,用BD CPT 管或Ficoll提取液收集外周血單個(gè)核細(xì)胞,結(jié)核特異抗原（ESAT-6/CFP 10）刺激結(jié)核特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞使其分泌γ-干擾素,效應(yīng)T淋巴細(xì)胞分泌的γ-干擾素與膜板預(yù)包被的抗γ-干擾素抗體結(jié)合并固定在細(xì)胞周圍,1個(gè)斑點(diǎn)=1個(gè)效應(yīng)T細(xì)胞,加入顯色液，觀察結(jié)果,過夜孵育，洗板，加入酶標(biāo)二抗,,實(shí)驗(yàn)

18、效果圖,方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn),檢測(cè)特異性的提高幫助臨床區(qū)分卡介苗接種和環(huán)境分枝桿菌感染引起的“假陽性”，避免了臨床的無效用藥檢測(cè)靈敏度的提高有利于臨床對(duì)結(jié)核病的早發(fā)現(xiàn)、早治療，避免了疾病的傳播與擴(kuò)散快速48小時(shí)出結(jié)果,,方法學(xué)的局限,不能區(qū)分活動(dòng)性TB與潛伏感染不能夠提示臨床患者的病變部位，需要結(jié)合臨床的判斷目前還不能夠根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)量的多少來判斷患者是活動(dòng)性結(jié)核病或是潛伏感染者檢測(cè)收費(fèi)高（800元/次）,,實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋,陰性結(jié)果

19、提示患者體內(nèi)不存在針對(duì)結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細(xì)胞。假陰性結(jié)果：①感染階段不同；②少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不全/疾?。虎蹖?shí)驗(yàn)非正常操作。 陽性結(jié)果提示患者體內(nèi)存在針對(duì)結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細(xì)胞，患者存在結(jié)核感染。但是否是活動(dòng)性結(jié)核病，需結(jié)合臨床癥狀和其它檢測(cè)指標(biāo)綜合判斷。假陽性結(jié)果：① 4種環(huán)境分枝桿菌感染時(shí)：M.kansasii（堪薩斯）、M.szulgai（蘇氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）,,各國對(duì)潛伏

20、感染風(fēng)險(xiǎn)人群的篩查指南,,樣本量為26 680 調(diào)查者的15個(gè)多中心研究顯示,在4年的隨訪中,IGRA-陽性的個(gè)體中發(fā)病數(shù)為4~48 例/1000人/每年.,2011年9月的研究結(jié)果提示，IGRA-陰性對(duì)于兒童（小于5歲）不能排除結(jié)核病(Pediatr. Infect. Dis. J.30, 817–818, 2011). Childhood tuberculosis treatment remains imprecise scien

21、ceNature MedicineVolume:17,Page:116011 October 2011.,TB-DNA檢測(cè)：1. 能穩(wěn)定檢測(cè)10copy的TB-DNA ，靈敏度高 ，特異性強(qiáng)。2. 早期、快速、準(zhǔn)確地診斷結(jié)核病。 痰液、肺及支氣管灌洗液——肺結(jié)核 血液——播散性結(jié)核和各臟器的結(jié)核病 　 腦脊液——中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病 宮頸拭子、尿道拭子—

22、—泌尿生殖道結(jié)核病3. 熒光定量PCR檢出結(jié)核桿菌陽性率顯著高于痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)法。4. TB-DNA濃度可用于判斷療效： 痰標(biāo)本中結(jié)核桿菌的數(shù)量呈逐漸下降趨勢(shì) ，TB-DNA拷貝數(shù)下降。根據(jù)病原體DNA濃度，對(duì)藥物治療及療效觀察提供參考依據(jù) 。,③分子生物學(xué)診斷,,,Real-time PCR,環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)的技術(shù)特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 條特異引物，利用一種鏈置換DNA

23、聚合酶在等溫條件(63-65℃)下保溫30－60分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。,環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù),2小時(shí)全過程,目測(cè)法檢測(cè)流程,檢測(cè)方法說明,結(jié)果判斷,在陰性對(duì)照反應(yīng)管液體顏色呈橙色，陽性對(duì)照反應(yīng)管液體顏色呈綠色的條件下： 若待檢樣本反應(yīng)管中液體顏色呈綠色，則可報(bào)告該樣本檢測(cè)結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌陽性； 若待檢

24、樣本反應(yīng)管中液體顏色呈橙色，則可報(bào)告該樣本檢測(cè)結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌陰性； 若陰陽性對(duì)照反應(yīng)管結(jié)果與上述情況不符，則本次檢測(cè)結(jié)果無效，應(yīng)重新檢測(cè)。,RNA作為臨床分子診斷靶標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)：,RNA 拷貝數(shù)≥ DNA拷貝數(shù)更具臨床意義: 生命力旺盛的病原體RNA轉(zhuǎn)錄活躍RNA遠(yuǎn)不如DNA穩(wěn)定病原體死亡，RNA很快降解 1.交叉污染少 2.較好的愈后指標(biāo),結(jié)核桿菌RNA(TB-RNA),SAT技術(shù)原理,操作過

25、程,4. 結(jié)核病的分子藥敏,HAIN 技術(shù),DNA?STRIP®,T-spot,-Xpert MTB/ RIF,DNA微陣芯片,探針熔解曲線技術(shù),原理：采用線性探針技術(shù)（LiPA），擴(kuò)增后的產(chǎn)物與預(yù)先固化在膜上的特異性探針雜交，通過顯色反應(yīng)判斷結(jié)果。檢測(cè)標(biāo)本：涂陽痰標(biāo)本/TB-DNA陽性標(biāo)本固體或液體培養(yǎng)菌株,① Hain 技術(shù),GT-Blot 48自動(dòng)雜交儀1臺(tái),所需設(shè)備：,GTQ PCR－96擴(kuò)增儀1臺(tái),Mikro

26、 220 離心機(jī)1臺(tái),恒溫器1臺(tái),超聲波振蕩儀1臺(tái),TARGET,MTBDRplus 方法,原理：PCR擴(kuò)增檢測(cè)rpoB、katG和inhA基因突變位點(diǎn)，診斷RFP和INH耐藥。,,rpoB 野生型探針: WT1 - WT8rpoB 耐藥突變探針: MUT1-3: D516V, H526Y, H526D, S531L→ 通過缺失的野生型信號(hào)進(jìn)行突變探測(cè)→ 通過出現(xiàn)的突變信號(hào)進(jìn)行突變探測(cè),MTBDRplus rpoB,,,MTBDR

27、plus 操作流程,DNA提取用NALC/NaOH處理痰標(biāo)本,2) PCR擴(kuò)增,3) 雜交擴(kuò)增產(chǎn)物和固化在膜上的特異性探針雜交,4) 結(jié)果判讀,MTBDRplus 反應(yīng)條帶(示范),,,Bandelette MTBDR® (Hain Lifescience),,鑒定結(jié)核菌,,利福平rpoB,INHkatG 315,,,,,靈敏度：86.5% (45/52)特異度：100%(16/16)符合率：89.7%(61/

28、68),菌株標(biāo)本 GenoType MTBDRplus方法與比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較,靈敏度：98.0% (48/49)特異度：100%(16/16)符合率：98.5%(64/65),菌株標(biāo)本 GenoType MTBDRplus方法與比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較,痰標(biāo)本（涂片陽性）GenoType MTBDRplus方法與比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較,靈敏度：98.4% (63/64)特異度：100%(129/129)符合率：99.5%(1

29、92/193),痰標(biāo)本（涂片陽性）GenoType MTBDRplus方法與比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較,靈敏度：95.1% (39/41)特異度：92.1% (140/152)符合率：92.7% (179/193),優(yōu)點(diǎn)：Hain 技術(shù)可以快速檢測(cè)RFP和INH的耐藥時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、安全高 特異性和靈敏度較高、重復(fù)性好主觀因素影響小、更為可靠,缺點(diǎn):需要專門設(shè)備；未發(fā)現(xiàn)所有的耐藥突變位點(diǎn)，不能檢測(cè)所有藥物的耐藥基因型；M

30、TBDR plus試劑盒的檢測(cè)試紙條，缺少ahpC-oxyR間隔序列范圍，否則可進(jìn)一步提高INH耐藥檢測(cè)的敏感性；不能取代傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)、只能作為參考。,進(jìn)行標(biāo)本處理、實(shí)時(shí)PCR和利福平耐藥性檢測(cè)的完整平臺(tái)此平臺(tái)由FIND和Cepheid（一個(gè)加州公司）所開發(fā)痰標(biāo)本可以直接放入模塊中，而無需與任何試劑進(jìn)行混合處理GeneXpert 設(shè)備可進(jìn)行標(biāo)本液化、去污染、富集、DNA提取、 rpoB實(shí)時(shí)擴(kuò)增、應(yīng)用分子燈塔檢測(cè)耐藥相關(guān)的突變

31、該系統(tǒng)非常容易使用，不需要進(jìn)行分子生物學(xué)培訓(xùn)該檢測(cè)方法另外一個(gè)特點(diǎn)是操作完全自動(dòng)化，使用起來既容易又安全。,②. Xpert MTB/RIF,設(shè)計(jì)五個(gè)重疊的分子信標(biāo)，檢測(cè)81堿基 rpoB核心區(qū)域所有可能的突變用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記每個(gè)分子信標(biāo)，使僅在一個(gè)反應(yīng)中完成整個(gè)檢測(cè)成為可能探針能檢測(cè)野生型菌株（RIF-敏感人群）；ropB突變?cè)斐商囟ㄐ艠?biāo)的信號(hào)丟失 （RIF-耐受人群）每個(gè)探針必須：能檢測(cè)野生型菌株；不能檢測(cè)Rif耐

32、藥突變菌株，不能檢測(cè)出非TB分枝桿菌.,Xpert MTB/RIF的引物設(shè)計(jì),Xpert MTB/RIF,WHO推薦,Xpert MTB/RIF 與 Hain的比較 ：,只能做TB-DNA和利福平耐藥基因；只能通過8個(gè)缺失的野生型信號(hào)進(jìn)行突變檢測(cè)，不能探檢測(cè)出現(xiàn)的突變信號(hào)；樣本通量少(4個(gè)/次）；所需樣本量大（1mL/次）；儀器斷電后只能重新開始； Hain有記憶功能。維護(hù)：剛進(jìn)入中國市場(chǎng)，故障后只能返廠修理，費(fèi)用昂貴。,③.

33、 DNA微陣芯片,基本原理：與Southern、Northern是一致的，都是應(yīng)用已知核酸序列作為探針固定在玻璃等基片上，然后與待測(cè)樣品的DNA或RNA互補(bǔ)的靶核苷酸序列雜交，從而獲得待測(cè)樣品的信息,基因芯片的檢測(cè)過程,,,,結(jié)核耐藥快速檢測(cè)基因芯片,73,結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒（DNA微陣列芯片法）基于rpoB/katG/inhA的基因突變，快速檢測(cè)分離株或者痰樣本中結(jié)核分枝桿菌多藥耐藥（利福平、異煙肼）通 量：兩種

34、一線抗結(jié)核藥物、8個(gè)突變位點(diǎn)速 度：6小時(shí)versus 傳統(tǒng) 4~8 周靈敏度： 103 CFU/反應(yīng)特異性：防污染體系；對(duì)照設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)；自動(dòng)判讀,發(fā)表文章：The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 2009, 13(7): 914–920.發(fā)明專利：申請(qǐng)?zhí)枺?200810105172.X。授權(quán)公告號(hào)：CN 101285062 B。,1.晶芯

35、74;分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒2.晶芯®十七種分枝桿菌菌種鑒定試劑盒3.晶芯®分枝桿菌耐藥檢測(cè)試劑盒4.晶芯®九項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒,DNA微陣芯片,④.探針熔解曲線技術(shù),,檢測(cè)結(jié)果判斷,,Sputum,,涂片,培養(yǎng)—孵育8周（陽性）,藥敏試驗(yàn)—觀察 孵育4周觀察生長(zhǎng)情況,涂片/TB-DNA/ TB-RNA （陽性）,分子診斷/藥敏技術(shù),液體培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn),,,,,,平均時(shí)間2-3個(gè)月,,平