豬腹瀉病原多重PCR檢測方法的建立及主要病毒進化分析.pdf

1、豬薩佩羅病毒（Porcine sapelovirus，PSV）、豬嵴病毒（Porcine kobuvirus，PKV）、豬星狀病毒（Porcine astrovirus，PAstV）、豬德爾塔冠狀病毒病（Porcine Deltacoronavirus，PDCoV）、豬環(huán)曲病毒（Porcine torovirus，PToV）、豬捷申病毒(Porcine teschvoirus，PTV)、豬札幌病毒(Porcine sapovirus，P

2、SaV)是一類均可引起豬消化道疾病的病毒，主要導(dǎo)致豬出現(xiàn)一系列的腹瀉癥狀，而且常表現(xiàn)為兩種以上病原的混合感染。多重PCR方法具有敏感性和特異性高且可以同時檢測多種病原等優(yōu)點，比較適合用于混合感染的快速診斷。因此，本研究針對七種病毒的保守序列分別設(shè)計一對特異性引物，建立了可以同時檢測這七種病毒感染的多重PCR方法，并將此方法用于臨床樣品的檢測，證實建立的方法靈敏度好，特異性強，能用于臨床鑒別診斷。對豬腹瀉糞便中七種病毒的臨床檢驗分析發(fā)現(xiàn)P

3、SV、PKV、PAstV的陽性率較高，為了了解這三種病毒的進化特點，挑選3株P(guān)SV和PKV，2株P(guān)AstV進行全基因組序列測定及分析。
　　1.PSV、PKV、PAstV、PDCoV、PToV、PTV和PSaV多重RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用
　　合成了七對特異性引物分別用于擴增PSV、PKV、PAstV、PDCoV、PToV、PTV和PSaV基因序列，目的片段的大小分別為624bp、280bp、249bp、504b

4、p、421bp、176bp、340bp。通過優(yōu)化多重RT-PCR的反應(yīng)條件，建立了可以同時檢測這七種病毒的多重RT-PCR方法。該多重RT-PCR的特異性、重復(fù)性均良好，靈敏性可達到pg級水平。使用該方法檢測492份來自上海地區(qū)的豬腹瀉糞便樣品，其中PKV的感染率最高達到41.9％（206/492），PAstV和PSV的感染率次之，分別為31.1%（153/492）、15.7%（77/492）。對檢測結(jié)果統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，492份臨床樣品中有2

5、8.7%（141/492）的樣品中存在2種及以上的病毒感染，主要是PKV和PAstV；13.0%（64/492）的樣品中存在3種及以上的病毒感染，主要是PKV、PAstV和PSV；3.2%（16/492）的樣品中存在4種及以上的病毒感染，主要是PKV、PAstV、PSV與PDCoV；2份（0.6%）樣品中存在PKV、PAstV、PSV、PSaV與PDCoV混合感染，；1份樣品中存在PKV、 PAstV、PSV、PSaV、PDCoV與PT

6、V混合感染。
　　2.PSV、PKV、PAstV全基因組序列的擴增及進化分析
　　鑒于PSV、PKV、PAstV有較高的感染率，為深入了解這3種病毒的基因組分子特性，實驗從陽性樣品中挑選3株P(guān)SV和PKV、2株P(guān)AstV，進行全基因組序列的擴增，并進行遺傳進化分析。測序結(jié)果顯示：我們的3株P(guān)SV全基因組序列與國內(nèi)報道的毒株序列親緣性較近，而與美國、德國、韓國代表株的遺傳距離較遠，并對VP1基因進行序列比對分析，表明這3個毒株

7、的VP1基因與德國分離株P(guān)o5116同源性最低，而與中國分離株YC2011相似性最高。3株P(guān)KV之間的全基因組同源性不高，僅達88.1%-89.1%，說明上海不同地區(qū)流行的PKV毒株之間存在著一定的變異，但VP1基因進化樹表明，它們與日本株P(guān)KV的親緣性最近，由此推測，近年來我國流行的PKV和日本株 PKV之間有著一定的相似性，很有可能是從日本株變異而來。另外，2株P(guān)AstV的全基因組同源性僅73.8%，歸屬于不同的亞群，與不同國家的P